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止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的临床及实验研究

作　者: 季成春
导　师: 田振国
学　校: 辽宁中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 止痛润肠浓煎饮术后便秘混合痔水通道蛋白3 一氧化氮合酶前列腺素E2 动物模型毒理
分类号: R266
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：便秘是混合痔术后常见的并发症之一，一旦发生将给患者带来严重的不良后果。本课题旨在通过临床研究观察止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的疗效及不良反应；通过动物试验检测止痛润肠浓煎饮可能存在的毒性；探讨符合混合痔术后便秘临床特点的大鼠动物模型的制备方法；通过实验研究从基因及蛋白表达水平探讨止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的可能作用机制，为更好地推广应用提供理论依据。材料与方法：第一部分：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的临床研究将住院手术的混合痔患者随机分为两组。所有患者入院后完善各项相关检查，排除不符合研究标准的病例。两组患者均于骶管麻醉下行混合痔内扎外切创面开放术式（Milligan-Morgan），并根据需要加消痔灵注射术，术后在常规治疗的基础上，治疗组（n=41）术后给予止痛润肠浓煎饮口服，对照组（n=37）术后给予麻仁软胶囊口服。分别观察记录两组患者的术后首次排便时间，术后首次、第3-4天、6-7天及9-10天时间段内大便性状评分和排便时疼痛评分。第二部分：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的实验研究实验一：止痛润肠浓煎饮口服给药急性毒理试验研究选用SPF级昆明种小鼠30只，随机分为A、B、C三组，每组10只，雌雄各半进行预实验。所有动物给药前禁食不禁水16小时。A组每天给药1次；B组每天给药2次，间隔6h；C组每天给药3次，间隔4h。小鼠每次灌胃给予40ml/kg的止痛润肠浓煎饮的浓缩液(3.5g生药／ml)。然后按常规饲养，观察小鼠外观、行为活动、呼吸、分泌物、排便、死亡等情况，共观察7天。结果未见小鼠死亡，未能测出小鼠灌胃给药的半数致死量（LD50），故进行小鼠灌胃给药的最大给药量试验研究。选用SPF级昆明种小鼠40只，随机分为2组，分别为空白对照组及给药组，每组20只，雌雄各半。按止痛润肠浓煎饮的最大浓度(3.5g生药／ml)、小鼠一次灌胃最大容积(40ml／kg)给药，日3次，每次间隔4h；空白对照组给予等体积的纯净水，方法同给药组。第3次给药后两组小鼠均给予正常饮食，常规饲养14天。实验期间每天观察有无死亡、外观、行为、精神状态、分泌物、排泄物、饮食和中毒症状；给药前和给药后第7、14天分别称量小鼠的体重；在观察期结束后对存活动物进行大体解剖，记录相关情况，如有器官出现异常则对病变器官进行组织病理学检查。实验二：混合痔术后便秘大鼠模型的制备将24只SD大鼠随机分成3组：正常对照组、模型组和模型恢复组。每组8只，雌雄各半。造模方法根据文献报道及预实验结果进行。第1-3天模型组和模型恢复组大鼠禁水不禁食，给予洛哌丁胺悬浊液3mg/kg，灌胃日2次，间隔6h。正常对照组大鼠正常饮食，给予同体积纯净水灌胃，方法同模型组。第4天模型组和模型恢复组行肛门手术，正常对照组行假手术。模型组术后继续给予洛哌丁胺悬浊液3mg/kg，约2ml，灌胃日2次，间隔6h，并给予正常饮水量1/6（8ml）的纯净水，鼠粮不限。模型恢复组和正常对照组术后不限饮食。第5天以后各组大鼠给药及饮食情况同第4天。肛门手术方法：乙醚麻醉成功后，将大鼠固定于解剖台上，碘伏消毒肛周皮肤，取肛管右后及左侧各做一放射状梭形切口，深达皮下，长约0.6cm，最宽处约0.2cm，内达直肠与肛管交界，外达肛缘。假手术方法，除不做切口外其它操作同上。观察造模开始前一日及开始后每日进食量、排便量、饮水量及排便的难易程度，新排出粪便的质地，并测量计算新鲜粪便含水率。实验三：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的实验研究将48只SD大鼠随机分成6组：A组（正常对照组）、B组（模型组）、C（组麻仁软胶囊组）、D组（低剂量治疗组）、E组（中剂量治疗组）和F组（高剂量治疗组），每组8只，雌雄各半。依照实验二方法造混合痔术后便秘模型，肛门手术后开始灌胃给予治疗药物，于洛哌丁胺灌胃后间隔2h给予。A、B组给予生理盐水（NS）2ml，日2次；C组给予麻仁软胶囊混悬液（0.0075g/ml）2ml，日2次，为人鼠等效剂量；D组给予止痛润肠浓煎饮（0.6g生药/ml）2ml，日2次，约为成人常用等效剂量1/2；E组给予止痛润肠浓煎饮（1.2g生药/ml）2ml，日2次，约为成人常用等效剂量；F组给予止痛润肠浓煎饮（2.4g生药/ml）2ml，日2次，约为成人常用等效剂量2倍。观察各组大鼠手术后排便情况，统计每24小时排便量及新鲜粪便含水率各组大鼠在术后48h第5次给药后禁食水4h，各组大鼠均给予活性炭凝胶灌胃，剂量4ml/只。灌胃结束30min后，大鼠乙醚麻醉，取倒“T”形切口打开腹腔，腹主动脉采血至大鼠死亡。采血管室温静置20min，离心，3000rpm，20min，分别取血清0.5ml于EP管中，置入-80℃超低温冰箱保存。取出自幽门至盲肠全部小肠，拉直平铺于白纸上。取近端结肠组织，生理盐水冲洗肠腔内容物，分成两段，其一应用4%多聚甲醛固定，其二置于超低温冰箱-80℃冷藏。测量并计算小肠活性炭凝胶推进长度和推进率；ELISA检测血清前列腺素E2（PGE2）水平；RT-PCR检测近端结肠水通道蛋白3（AQP3）mRNA表达温水平；免疫组化检测近端结肠粘膜AQP3、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达情况。结果：第一部分：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的临床研究术后首次排便时间，治疗组较对照组缩短，但无统计学差异（p>0.05）；与对照组相比，术后首次、第3-4天大便性状评分明显优于对照组（P＜0.01），第6-7天时亦有差异（P＜0.05），至第9-10天两者差异不显著（P>0.05）；与对照组相比，术后首次、3-4d大便疼痛评分明显低于对照组（P＜0.01），6-7d时亦有差异（P＜0.05），至9-10d两者差异不显著（P>0.05）。第二部分：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的实验研究实验一：止痛润肠浓煎饮口服给药急性毒理试验研究结果表明，小鼠在上述剂量灌胃给药后未见小鼠死亡，未能测出小鼠灌胃给药的半数致死量（LD50），故进行小鼠灌胃给药的做最大给药量实验研究。止痛润肠浓煎饮以最大给药量给予小鼠后，精神状况良好，毛色光亮，呼吸通畅、均匀，行为、分泌物、小便等均无异常。给药组给药后出现大便含水量增加，颜色变黑（中药颜色），个别呈稀糊状，1天后自动恢复正常，小鼠体重增长正常。给药组受试小鼠体重与空白对照组比无明显差异（P>0.05）。实验结束大体解剖各小鼠心、肺、肾、肝、脾、胃肠道等主要脏器均未见异常，故未进行组织病理学检查。实验二：混合痔术后便秘大鼠模型的制备1.在造模前测得正常情况下大鼠24h饮水量（48.25±4.15ml）、进食量（24.22±1.11g/d）、排便量（4.14±0.58g/d）及新鲜粪便含水率（58.16±2.95%），三组比较均无统计学差别（p>0.05）。2.实验开始第2日上午9：00（即模型组禁水24h）模型组及模型恢复组进食量、排便量及新鲜粪便含水率与对照组相比有所下降，但无统计学差异（p>0.05）。3.第3日上午9：00（即模型组禁水48h）模型组及模型恢复组进食量、排便量及新鲜粪便含水率与对照组相比明显下降，有统计学差异（p<0.01）。4.第4日上午9：00（即模型组禁水72h）模型组及模型恢复组进食量、排便量及新鲜粪便含水率与对照组相比进一步明显下降，统计学差异显著（p<0.01）。5.第5日上午9：00（即模型组手术后24h）模型组进食量、排便量及新鲜粪便含水率与对照组相比明显下降，统计学差异显著（p<0.01）。模型恢复组与对照相比饮水量明显增加（p<0.01），进食量、排便量及新鲜粪便含水率仍低于对照组（p<0.01），但均明显高于模型组（p<0.01）。6.第6日上午9：00（即模型组手术后48h）模型组进食量、排便量及新鲜粪便含水率与对照组相比明显下降，统计学差异显著（p<0.01）。模型恢复组与对照相比饮水量、进食量、排便量及新鲜粪便含水率无显著差异（p>0.05）。7.三组大鼠排便量及新鲜粪便含水率随时间变化结果：正常对照组无明显变化；模型组与模型恢复组大鼠自造模开始排便量及新鲜粪便含水率逐渐减少，模型组在造模结束后排便量及新鲜粪便含水率继续减少并维持在低水平，而模型恢复组在祛除造造模因素后，排便量及新鲜粪便含水率在48小内快速恢复至正常。实验三：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的实验研究1．排便量及新鲜粪便含水率与A组（正常对照组）相比，其它各组大鼠术后24小时排便量及新鲜粪便含水率均明显降低（P<0.01）；与B组（模型组）相比术后24h排便量及新鲜粪便含水率C组（麻仁软胶囊组）、D组（低剂量治疗组）均增加，但无统计学差异（P>0.05），E组（中剂量治疗组）明显增多（P<0.05），F组（高剂量治疗组）增加更显著（P<0.01）；与A组（正常对照组）相比，其它各组大鼠术后48小时排便量及新鲜粪便含水率均明显降低（P<0.01）；与B组相比，术后48h排便量C组、D组均明显增加（P<0.05），E、F组增加更显著（P<0.01）；术后48h新鲜粪便含水率C、D、E、F组显著升高（P<0.01）。与C组相比，48h排便量及新鲜粪便含水率D组无差别（P>0.05），E组明显增加（P<0.05），F组显著增加（P<0.01）；与D组相比，48h排便量及新鲜粪便含水率E组明显增加（P<0.05），F组显著增加（P<0.01）；E组与F组相比无差别。止痛润肠浓煎饮对排便量及粪便含水率的影响呈量效依赖关系。2．小肠活性炭凝胶推进长度和推进率与A组（正常对照组）相比其它各组无论是小肠活性炭凝胶推进长度还是推进率均显著降低（P<0.01）；与B组（模型组）相比，各治疗组推进长度和推进率均显著改善（P<0.01）；与C组（麻仁软胶囊组）相比，D组（低剂量治疗组）无差别（P>0.05），E组（中剂量治疗组）增加明显（P<0.05），F组（高剂量治疗组）增加显著（P<0.01）；与D组相比，E组增加明显（P<0.05），F组增加显著（P<0.01）；E组与F组差别不显著（P>0.05）；止痛润肠浓煎饮对小肠活性炭凝胶推进长度和推进率的影响具有量效依赖关系。3．各组大鼠血清PGE2水平与A组（正常对照组）相比，模型组及各治疗组PGE2水平均明显升高（P<0.01）；而各治疗组PGE2水平与B组（模型组）相比都有下降，其中C组（中麻仁软胶囊组）及D组（低剂量治疗组）下降无统计学差异（P>0.05），E组（中剂量治疗组）、F组（高剂量治疗组）下降最为明显（P<0.01）；E、F组均明显低于C和D组（P<0.01）；E组与F组间无统计学差异（P>0.05）。4．各组大鼠结肠AQP3mRNA表达水平与A组（正常对照组）相比，B组（模型组）近端结肠AQP3mRNA表达水平显著下调（P<0.01），C组（麻仁软胶囊组）、D组（低剂量治疗组）无统计学差异（P>0.05），E组（中剂量治疗组）、F组（高剂量治疗组）明显上调，统计学差异显著（P<0.01）；与B组相比，C、D、E、F组AQP3mRNA表达水平均显著上调（P<0.01）；C组与D组间无统计学差异（P>0.05）；E、F组均明显高于C、D组（P<0.01）；E组和F组间无统计学差异（P>0.05）。5．各组大鼠AQP3、iNOS免疫组化结果比较与A组（正常对照组）相比，B组（模型组）表达下调（P<0.01），C组（麻仁软胶囊组）、D组（低剂量治疗组）和E组（中剂量治疗组）无显著差别（P>0.05），F组（高剂量治疗组）表达上调（P<0.05）；与B组相比，C组、D组表达无差别，E组表达上调（P<0.01），F组上调更明显（P<0.01），但E、F组之间相比并无统计学差异（P>0.05）。A组大鼠结肠iNOS呈低表达或不表达，而B组大鼠结肠iNOS表达比A组明显增加（P<0.01），各治疗组与A组相比iNOS表达也有不同程度的上调(p<0.01)。与B组相比，C组与D组表达无明显差别（P>0.05），E组表达水平降低（P<0.05），F组降低更为明显（P<0.01），但E、F组之间相比并无统计学差异（P>0.05）。结论：1．混合痔术后患者口服止痛润肠浓煎饮具有促进排便、软化大便、减轻疼痛的作用，且不易引起腹泻。应用止痛润肠浓煎饮是临床中防治混合痔患者术后便秘的有效方法。2．止痛润肠浓煎饮短期应用无明显毒性作用，临床应用安全。3．联合应用限水、灌服洛哌丁胺及肛门手术制作混合痔术后便秘大鼠模型是可行的，符合临床混合痔患者术后便秘的病理生理特点，稳定性好，可供进一步动物实验使用。4．止痛润肠浓煎饮能增加混合痔术后便秘大鼠的排便量及新鲜粪便含水率，并呈量效依赖关系。5．止痛润肠浓煎饮能增加混合痔术后便秘大鼠小肠活性炭凝胶推进长度及推进率，具有促进肠蠕动作用。6．止痛润肠浓煎饮可降低混合痔术后便秘大鼠血清PGE2水平，减轻肛门疼痛程度。7．混合痔术后便秘大鼠结肠AQP3mRNA及蛋白表达下调，应用止痛润肠浓煎饮治疗后表达上调，说明AQP3可能参与了止痛润肠浓煎饮对肠道水液代谢的调节作用。8．正常大鼠结肠iNOS呈低表达或不表达，混合痔术后便秘大鼠结肠iNOS表达增强，应用止痛润肠浓煎饮可下调iNOS表达，增强肠动力。

全文目录

摘要  5-11
Abstract  11-21
前言  21-22
文献综述  22-37
第一部分：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的临床研究  37-42
  1 研究资料与方法  37-39
  2 疗效观察  39
  3 结果  39-41
  4 结论  41-42
第二部分：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的实验研究  42-77
  实验一：止痛润肠浓煎饮口服给药急性毒理试验研究  42-45
    1 实验材料  42
    2 试验方法  42-43
    3 结果  43-44
    4 结论  44-45
  实验二：混合痔术后便秘大鼠模型的制备  45-52
    1 实验材料  45
    2 实验方法  45-47
    3 结果  47-50
    4 结论  50-52
  实验三：止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的实验研究  52-76
    1 实验材料  52-54
    2 实验方法  54-60
    3 结果  60-65
    4 结论  65-66
    分析讨论  66-76
  结论  76-77
附图  77-79
参考文献  79-93
致谢  93-94
个人简历  94

止痛润肠浓煎饮防治混合痔术后便秘的临床及实验研究

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