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凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子和细胞黏附蛋白基因的克隆与序列分析

作　者: 岳磊磊
导　师: 郑喜邦
学　校: 广西大学
专　业: 临床兽医学
关键词: Litopenaeus vannamei 酚氧化酶原激活因子 细胞黏附蛋白基因 IHHNV病毒 序列分析
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


无脊椎动物没有真正的抗体和获得性免疫系统,主要依靠先天性免疫系统来抵御外来病原微生物的侵害。酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidase activating system, pro-PO)是无脊椎动物先天免疫机制中具有重要作用的免疫系统。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase activating factor, PPAF)和细胞黏附蛋白(Peroxinectin, PX)基因是酚氧化酶原激活系统中的两个重要因子,这些免疫相关因子是如何抵御病原微生物入侵,如何参与机体的免疫活动一直以来受到广泛关注,因此本研究通过RACE方法首次克隆了PPAF的cDNA全长(GenBank登录号JQ684529),及PX基因的部分序列,并对2个基因序列进行初步分析；通过半定量PCR分别对2个基因进行了不同组织的表达谱分析,研究结果如下：1.PPAF基因cDNA全长1986bp,其中含有一个1629bp开放阅读框(ORF),两翼分别存在21bp(5’端)和336bp(3’端)的非翻译区。该基因的开放阅读框共编码542个氨基酸,以SMART软件分析该氨基酸序列,269-517a区域是其功能域,是胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶；494-502a区域有一个ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位点；316-321a区域有一个组氨酸酶活性位点。进化树分析表明凡纳滨对虾PPAF基因与斑节对虾的同源性最高,与果蝇、蚊的同源性最低。通过半定量PCR分析发现该基因在正常对虾的心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量没有差别,血液中的表达量明显高于其他组织；在感染IHHNV病毒的对虾的组织中的表达量下降明显,但是血液中的表达量仍明显高于其他组织。2.PX基因部分cDNA序列长度为1529bp,分析发现该序列含有1个1308bp的开放阅读框(ORF),3’端含有1个长度为221bp的非翻译区,开放阅读框共编码436个氨基酸。所获得的PX氨基酸序列理论等电点为4.64,分子量为48.86945KDa。经Signal P软件分析发现此氨基酸序列在72-86a区域有信号肽特征,82a是信号肽剪切位点的可能性最大。通过Motif Scan程序对其氨基酸序列进行分析,发现该氨基酸序列在其336-378a处有氧化物酶功能域；在172-179a处有一个八肽铜锚定位点；进化性分析表明PX序列与斑节对虾编码的氨基酸序列最高,与果蝇的相似度最低；半定量PCR分析发现该基因在正常对虾的血液中表达量最高,肝胰腺次之,在心脏、肠、胃和肌肉中的表达量没有差别,该基因在IHHNV病毒感染对虾的血液、心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量下降明显,但在血液和肝胰腺中的表达量仍比其他组织要高。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章 文献综述  13-25
  1.1 前言  13
  1.2 凡纳滨对虾的免疫系统概述  13-19
    1.2.1 物理屏障  14-15
    1.2.2 细胞免疫系统  15-17
      1.2.2.1 细胞吞噬  15-16
      1.2.2.2 细胞粘连  16
      1.2.2.3 包囊作用和结节形成  16-17
    1.2.3 体液免疫  17-19
      1.2.3.1 抗菌肽(anti-microbial peptides)  17
      1.2.3.2 凝集素  17-18
      1.2.3.3 血淋巴凝结  18
      1.2.3.4 溶菌酶  18
      1.2.3.5 血蓝蛋白  18-19
      1.2.3.6 酚氧化酶原系统  19
  1.3 酚氧化酶原激活系统概述  19-21
    1.3.1 酚氧化酶原和酚氧化酶  20-21
  1.4 酚氧化酶原激活因子及其研究进展  21-23
  1.5 Peroxinectin及其研究进展  23-24
  1.6 研究目的和意义  24-25
第二章 凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子全长cDNA克隆及序列分析  25-41
  2.1 材料与方法  25-30
    2.1.1 实验动物  25
    2.1.2 主要试剂  25
    2.1.3 实验方法  25-30
      2.1.3.1 攻毒及样品采集  25-26
      2.1.3.2 总RNA的提取与cDNA第一链合成  26-27
      2.1.3.3 酚氧化酶原激活因子cDNA的克隆及测序  27-29
        2.1.3.3.1 酚氧化酶原激活因子部分cDNA的克隆及测序  27-28
        2.1.3.3.2 酚氧化酶原激活因子RACE扩增、克隆与测序  28-29
      2.1.3.4 序列的拼接与生物信息学分析  29
      2.1.3.5 半定量RT-PCR  29-30
  2.2 结果与分析  30-39
    2.2.1 总RNA的提取  30
    2.2.2 PPAF基因的分离鉴定与生物信息学分析  30-38
      2.2.2.1 凡纳滨对虾PPAF基因cDNA的分离与鉴定  30-31
      2.2.2.2 凡纳滨对虾PPAF基因RACE的分离与鉴定  31-32
      2.2.2.3 凡纳滨对虾PPAF基因序列分析  32-34
      2.2.2.4 PPAF氨基酸序列功能分析  34-35
      2.2.2.5 凡纳滨对虾PPAF进化树的构建  35-38
    2.2.3 半定量PCR分析  38-39
  2.4 讨论  39-41
第三章 凡纳滨对虾细胞黏附蛋白基因克隆及序列分析  41-52
  3.1 材料与方法  41-44
    3.1.1 实验动物  41
    3.1.2 主要试剂  41
    3.1.3 实验方法  41-44
      3.1.3.1 细胞黏附蛋白基因RACE扩增、克隆与测序  41-43
      3.1.3.2 序列的拼接与生物信息学分析  43
      3.1.3.3 半定量RT-PCR  43-44
  3.3 结果与分析  44-50
    3.3.1 凡纳滨对虾PX基因RACE的分离与鉴定  44
    3.3.2 凡纳滨对虾PX基因序列分析  44-46
    3.3.3 凡纳滨对虾PX氨基酸序列比对与功能位点预测  46-49
    3.3.4 半定量PCR检测结果  49-50
  3.4 讨论  50-52
第四章 小结  52-53
参考文献  53-64
致谢  64-65
作者简介  65
攻读硕士学位期间发表的论文情况  65

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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