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皱纹昙蛤微卫星的筛选和特性分析

作　者: 孙飞
导　师: 张全启
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生物工程
关键词: 皱纹昙蛤微卫星磁珠富集遗传多样性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 3次
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内容摘要

皱纹昙蛤又名Rugose Tagelus,属于软体动物门、双壳纲、帘蛤目、昙蛤科、昙蛤属；另有俗名为Wrinkled Sea-green Mussel或Brown or Mud Mussel。根据世界海洋种类注册中心的记录显示,其最早是由Hanley于1843年发现并记录。皱纹昙蛤主要分布于亚洲印度太平洋区的热带水域,如澳大利亚、东印度群岛、马来西亚、新加坡等地。栖息环境多为浅海、泥质海湾。因味道鲜美而成为东南亚的美食之一。但目前在中国还未搜索到皱纹昙蛤人工养殖的相关记录；至于其生物遗传学研究记录更是完全空白。遗传标记是指可以用来追踪染色体或染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。在目前研究中应用较为广泛的遗传标记包括：形态学标记、细胞学标记、生物化学标记、免疫学标记和分子标记。微卫星作为第二代分子标记代表之一,又被称为短串联重复序列或简单重复序列,是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列,最早在1974年由Skinner等在研究寄居蟹(Pagurus policaris)的基因组时发现。由于微卫星重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性且数量丰富而呈现高度多态性,另外微卫星分离操作简单高效等优点使其广泛地应用于真核生物的种族遗传学研究中。目前微卫星在贝类中的应用主要包括：遗传图谱的构建、遗传多样性评估、种群遗传结构分析、种质资源评估和保护、亲缘关系鉴定等方面。本实验采用磁珠富集法从皱纹昙蛤DNA中筛选微卫星并进行特性分析：从24个由新加坡岛国收集的皱纹昙蛤个体样本中提取基因组DNA；利用生物素标记的三种探针与基因组DNA酶切片段进行杂交；再利用生物素与链亲和素亲和性强的特性,使用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成重复序列目标片段的富集；使用21-mer adapter作为引物对上述富集产物进行PCR扩增和检验后连接到pGEM-T载体上,然后转入大肠杆菌感受态细胞内并涂在含有氨苄抗体的LB培养基平板上进行培养；挑取含插入片段的阳性克隆利用通用引物M13和M13R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后,192个克隆被使用测序仪ABI3730x1(Applied Biosystems)进行了双向测序；测序结果经软件Sequencher (GeneCodes)软件分析和组装后共获得50个完全不同类型的微卫星片段；根据其中微卫星两侧具有足够长度的序列,使用Primer Select (DNA Star)设计,并由Sigma公司合成25对单向具有不同颜色FAM或HEX荧光标记的引物；使用这25对引物对24个皱纹昙蛤DNA进行扩增和测序后,利用软件GeneMapper Version3.5(Applied Biosy stems)和GDA对数据进行分析和统计后,其中有17对引物进行了特异性扩增并表现出不同高度的多态性,各位点的等位基因数介于5到14之间,平均值为8个；其中Glu01多态性最高,具有14个等位基因,Glu04多态性最低,只有5个；超过50bp的显著扩增片段大小差异的位点有5个,观察杂合度介于0.62到0.96之间,平均值为0.798,期望杂合度介于0.65到0.91之间,平均值为0.801,稍稍高于平均观察杂合度；采用卡方检验法进行检验,结果显示有11个微卫星的HWE (P)值大于0.05,符合Hardy-Weinberg遗传平衡。皱纹昙蛤味道鲜美、营养丰富,但目前还是未经人工选育和改良的野生品种,其遗传基础还是野生型；本实验筛选出的17个多态性微卫星位点从分子水平对其种群遗传多样性有了一定的了解,为了提高微卫星基因分型的效率,复合型PCR有必要被开发和利用；这些被筛选出来的微卫星为进一步利用更大群体进行遗传多样性分析、种群结构和种质资源保护提供了基础；更为将来选取优良种质资源培育出新品种,以进行规模化人工选育和养殖提供依据。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-15
第一章文献综述  15-31
  1 遗传标记的简介与分类  15-18
    1.1 形态学标记  15-16
    1.2 细胞学标记  16
    1.3 生化标记  16-17
    1.4 免疫学标记  17-18
    1.5 分子标记  18
  2 分子标记技术的发展  18-23
    2.1 第一代分子标记  18-19
      2.1.1 RFLP标记  19
      2.1.2 小卫星DNA  19
    2.2 第二代分子标记  19-22
      2.2.1 RAPD标记  20
      2.2.2 DAF标记  20-21
      2.2.3 AFLP标记  21
      2.2.4 SSR(微卫星)标记  21
      2.2.5 ISSR标记  21-22
    2.3 第三代分子标记  22-23
      2.3.1 SNP  22
      2.3.2 EST  22-23
    2.4 新型分子标记及展望  23
  3 微卫星(SSR)标记技术  23-30
    3.1 微卫星的发现与发展  23-24
    3.2 微卫星的产生原理  24
    3.3 微卫星的分类  24-25
    3.4 微卫星的特点  25
    3.5 微卫星的分布  25-26
    3.6 微卫星的开发  26-28
      3.6.1 基因组文库构建法  26
      3.6.2 富集法  26-27
        3.6.2.1 引物富集法  27
        3.6.2.2 尼龙膜富集法  27
        3.6.2.3 磁珠富集法  27
      3.6.3 数据库搜寻法  27-28
      3.6.4 近缘物种筛选法  28
    3.7 微卫星的功能及应用  28
    3.8 微卫星在贝类研究中的应用  28-30
      3.8.1 遗传图谱的构建  29
      3.8.2 种族遗传结构多样性分析  29
      3.8.3 种质资源评估与保护  29-30
      3.8.4 亲缘关系鉴定  30
  4 皱纹昙蛤简介  30-31
第二章磁珠富集法筛选皱纹昙蛤多态性微卫星  31-49
  5 材料  31-32
    5.1 昙蛤样品  31
    5.2 仪器设备  31-32
    5.3 试剂和药品  32
  6 步骤及方法  32-45
    6.1 昙蛤样品的DNA提取和检验  32-35
      6.1.1 基因组DNA的提取  32-33
      6.1.2 琼脂糖凝胶电泳检验  33-35
    6.2 酶切  35
    6.3 连接  35-36
    6.4 PCR扩增检测连接产物  36-37
    6.5 探针杂交与磁珠富集  37-38
      6.5.1 生物素探针杂交  37
      6.5.2 磁珠富集  37-38
    6.6 PCR扩增检验富集产物  38
    6.7 连接T载体  38-39
    6.8 转化  39
    6.9 阳性克隆筛选和鉴定  39-42
      6.9.1 培养基平板制备和使用  39-40
      6.9.2 阳性克隆挑选和鉴定  40-42
    6.10 测序及数据分析  42-43
    6.11 引物设计和筛选  43-44
    6.12 Genotyping PCR和数据分析  44-45
  7 结果  45-47
    7.1 微卫星序列分析  45-46
    7.2 微卫星引物检测结果  46
    7.3 等位基因数  46
    7.4 观测杂合度  46-47
    7.5 期望杂合度  47
    7.6 Hardy-Weinberg平衡检测  47
  8 讨论  47-49
    8.1 磁珠富集法分离微卫星的优缺点  47-48
    8.2 微卫星分子标记在皱纹昙蛤研究中的展望  48-49
参考文献  49-53
附表1 皱纹昙蛤中17个微卫星的特性分析  53-54
致谢  54-56
个人简历和攻读学位期间取得的成果  56

皱纹昙蛤微卫星的筛选和特性分析

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