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鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究

作　者: 贺奋义
导　师: 余四九
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鸽新城疫疫苗 F基因克隆原核表达 ELISA 真核表达
分类号: S858.39
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

鸽I型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus1，PPMV-Ⅰ)病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒(Avian Paramyxovirus1， PMV-Ⅰ)引起的一种急性、热性、高度性传染病。PPMV-Ⅰ引起鸽群突然发病，迅速蔓延，临床症状上与鸡新城疫嗜神经速发株引起的十分类似，主要临床特点是肠炎、下痢和神经症状，尤以嗜神经速发型为多见，发病率和死亡率都很高。鸽新城疫病其传播迅速、发病率高，发病后死亡率较高，死亡率可达50-80%以上，严重的可高达95%以上，处于孵化期的种胚感染后可全部死亡。给养鸽业造成的影响和危害巨大，是养鸽业重点防控的传染病之一。鸽新城疫病毒编码两种囊膜糖蛋白，融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)，F蛋白位于囊膜外表面，形成纤突，对鸽新城疫的毒力及感染性起决定性作用，是鸽新城疫的主要免疫原性蛋白；F基因还具有较高的遗传稳定性，是新城疫基因分型的主要依据，也是决定鸽新城疫致病力强弱的关键因素；F基因的遗传变异与鸽新城疫的变异和流行密切相关，是鸽新城疫分子流行病学研究的首选基因，因此，F基因是研究鸽新城疫核酸疫苗的首选目的基因。本文通过鸽新城疫种毒PL株在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究和病毒的灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了鸽新城制苗用病毒最佳制备方法和最佳灭活条件，在此基础上，研制出鸽新城疫油乳剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗，经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验、最佳免疫剂量测定，效力试验以及田间应用试验表明，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活疫苗不仅均匀度好，粘度低，通针性良好，注射后易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，而且免疫效果好，对鸽群免疫后能起到坚强的保护作用。此外，本文还用RT-PCR方法，从鸽新城疫病毒PL株基因组中克隆、鉴定了融合蛋白基因(F基因)，并在大肠杆菌中进行了高效表达，以纯化的F表达产物为抗原，建立了鸽新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法；同时，把鸽新城疫F基因插入酵母表达载体pPic9k和真核表达载体PC-DNA3.1/V5-His中，构建了鸽新城疫F基因毕赤酵母表达系统和F基因真核表达体系，为鸽新城疫F基因生物活性的进一步研究及新型核酸疫苗的研制奠定基础。本项目研究的主要内容包括：1、鸽新城疫种毒增殖规律和灭活方法的研究：采用鸽新城疫PL株为种毒，在鸡胚上连续盲传5代，使其扩大增殖，收获尿囊液做为基础种子毒。通过种子毒在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究表明，病毒在羊水、尿囊膜(包含羊膜)、尿囊液中含量较高、增殖动态趋于一致，而在胚体及卵黄中含量较低，接种病毒后72h为最佳收毒时间。经病毒的最佳灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了0.05%甲醛在20℃条件下经过48h；70℃的温度条件下经过20min灭活病毒为最佳灭活方法，不仅能有效的完全灭活病毒，而且能使病毒的血凝活性保持在94%以上。2、鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶灭活疫苗的制备：用70℃，20min的灭活方法分别制备尿囊液蜂胶佐剂灭活苗和四元材料(鸡胚尿囊液、羊水、尿囊膜、羊膜)混合蜂胶佐剂灭活苗，用0.05%甲醛在20℃条件下经48h的灭活方法分别制备鸽新城疫尿囊液蜂胶佐剂灭活苗、尿囊液油乳剂灭活苗和四元材料(尿囊液、尿囊膜、羊膜、羊水)混合油乳剂灭活苗。制备的六种疫苗经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验综合分析表明，均具有良好的抗原性和安全性。3.鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗的性能比较试验：用制备的六种鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗分别免疫注射乳鸽，结果表明四种蜂胶佐剂灭活苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，二种油乳剂苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，从而证明四元材料的疫苗与尿囊液毒疫苗的性能基本一致；但四元材料蜂胶佐剂灭活苗和油乳剂灭活苗在抗体产生时间及其达到峰值的时间和数值上有差异，蜂胶苗明显优于油苗。蜂胶佐剂灭活苗在免疫后5d抗体开始上升(平均为2.8log2～2.9log2)，14d抗体可达到高峰(平均为11.2log2～11.4log2)，而油乳剂灭活苗在免疫后9d抗体效价开始上升(平均为3.0log2～3.1log2)，21d才达到峰值(平均为9.0log2～9.2log2)。蜂胶佐剂灭活苗180d仍可维持较高水平(平均为6.6log2～6.7log2)；在免疫后30d、90d、180d用200ELD50强毒株攻击，其保护指数均为100%；对1日龄乳鸽接种1个使用剂量进行急性毒性试验观察，15d生长曲线表明，不影响鸽的生长，甚至有提高的趋势；室温保存3个月，4℃-8℃保存6个月，疫苗的物理性状和免疫保护性没有明显变化。4、鸽新城疫F基因的克隆及序列分析：通过设计一对引物，利用RT-PCR扩增以及亚克隆方法，从鸽新城疫病毒PL株中扩增出F基因，将扩增产物克隆进pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定筛选出阳性菌落并进行序列测定。结果表明：F基因为1662bp，编码553个氨基酸，与国内外报道的其他NDV毒株的F基因氨基酸数量相同；通过BLAST法与GenBank中国内外17个鸽源和鸡源部分新城疫毒株进行相似性比较及对照系统进化树的结果分析，表明我们的分离株（PL株）与17个毒株之间的相似性介于76.3-98.6%；对分离的鸽新城疫F融合蛋白的氨基酸序列与国内外8株新城疫氨基酸序列进行对比分析，结果氨基酸同源性为93.6%-96.7%；F0蛋白裂解位点的氨基酸组成为112R-R-R-K-R-F117，符合强毒株的序列。5、鸽新城疫F基因的原核表达及其生物活性研究：用PCR方法获得了缺失F蛋白信号肽、胞质区和跨膜区的F基因片段，将其亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中，与GST蛋白融合表达，经IPTG诱导和SDS-APGE分析，表明目的蛋白在大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物分子量约为60Kda；以表达的融合蛋白为抗原初步建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60min，与酶标二抗的最佳作用时间为60min，底物显色的最佳作用时间为15min。6、鸽新城疫F基因在毕赤酵母中表达：根据鸽新城疫F基因序列，设计引物，将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K，用SalI内切酶线性化后电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞，用影印法在含G418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌，用甲醇诱导表达并进行SDS-APGE分析。7、鸽新城疫F基因的真核表达及其生物活性研究：将鸽新城疫PL株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1V5-Hi中，构建出真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F；将构建的真核表达重组质粒免疫接种非免疫新城疫的乳鸽，并在免疫后第28d进行攻毒保护试验。结果表明，在免疫后第7d产生抗体，14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降；攻毒保护试验结果显示，对鸽新城疫强毒攻击保护率为33.33%（5/15），具有一定的免疫保护作用。

全文目录

摘要  3-7
Abstract  7-16
第一章文献综述  16-33
  1.1 鸽新城疫的研究概况  16-22
    1.1.1 病原学特性  17-19
    1.1.2 流行病学  19
    1.1.3 临床症状和剖检病变  19-20
    1.1.4 诊断  20-22
    1.1.5 防治  22
  1.2 新城疫分子生物学研究进展  22-33
    1.2.1 新城疫病毒的形态和分子结构蛋白及功能  23-26
    1.2.2 新城疫病毒致病力的分子基础  26-27
    1.2.3 新城疫的分子流行病学研究  27-30
    1.2.4 鸽新城疫基因工程疫苗研究  30-33
第二章鸽新城疫疫苗的研究  33-52
  2.1 材料和方法  35-40
    2.1.1 材料  35
      2.1.1.1 制苗用毒株  35
      2.1.1.2 试验动物  35
      2.1.1.3 试剂药品  35
      2.1.1.4 仪器设备  35
    2.1.2 方法  35-40
      2.1.2.1 种毒的制备  35-36
      2.1.2.2 病毒的灭活  36-37
      2.1.2.3 油乳剂灭活疫苗的制备  37
      2.1.2.4 蜂胶苗的配制  37-38
      2.1.2.5 油乳剂灭活苗物理性状检验  38
      2.1.2.6 蜂胶佐剂灭活苗物理性状检验  38-39
      2.1.2.7 疫苗免疫抗体产生时间的测定  39
      2.1.2.8 疫苗最佳免疫剂量测定  39
      2.1.2.9 疫苗免疫持续期的测定  39-40
      2.1.2.10 疫苗保存期试验  40
      2.1.2.11 对比试验  40
      2.1.2.12 区域试验  40
  2.2 结果  40-49
    2.2.1 制苗用毒在鸡胚上增殖  40-41
    2.2.2 病毒的灭活  41-42
      2.2.2.1 温度对病毒灭活  41
      2.2.2.2 甲醛对病毒灭活  41-42
      2.2.2.3 安全性检查  42
    2.2.3 油乳剂灭活疫苗物理性状检验  42-43
      2.2.3.1 外观检查  42
      2.2.3.2 粘度检验  42
      2.2.3.3 均匀度检验  42-43
      2.2.3.4 剂型检验  43
      2.2.3.5 稳定性检验  43
    2.2.4 蜂胶佐剂灭活疫苗物理性状检验  43-46
      2.2.4.1 外观检查  43
      2.2.4.2 无菌检验  43
      2.2.4.3 安全性检验  43-44
      2.2.4.4 急性毒性试验  44-46
    2.2.5 疫苗免疫效力对比试验  46-47
    2.2.6 疫苗免疫持续期试验  47-48
    2.2.7 疫苗保存期试验  48
    2.2.8 鸽源和鸡源油乳剂灭活苗对比试验  48-49
    2.2.9 区域试验  49
  2.3 讨论  49-51
  2.4 结论  51-52
第三章鸽新城疫 F 基因的克隆及序列分析  52-61
  3.1 材料与方法  52-54
    3.1.1 材料  52-53
      3.1.1.1 病毒  52
      3.1.1.2 菌株、载体  52
      3.1.1.3 主要试剂  52
      3.1.1.4 主要仪器  52-53
      3.1.1.5 培养基与溶液配制  53
    3.1.2 方法  53-54
      3.1.2.1 引物设计与合成  53
      3.1.2.2 病毒 RNA 的提取  53
      3.1.2.3 RT-PCR 扩增  53-54
      3.1.2.4 基因的克隆与鉴定  54
  3.2 结果  54-59
    3.2.1 F 基因的克隆鉴定  54-55
    3.2.2 F 基因 DNA 序列测定结果  55-56
    3.2.3 核苷酸相似性分析  56-57
    3.2.4 氨基酸序列分析  57-58
    3.2.5 裂解位点的氨基酸序列分析  58
    3.2.6 系统发育树的建立  58-59
  3.3 讨论  59-61
第四章鸽新城疫 F 基因的原核表达分析及其生物活性研究  61-78
  4.1 实验材料  61-64
    4.1.1 菌种、载体  61
    4.1.2 酶与试剂  61-62
    4.1.3 培养基与溶液配制  62-63
    4.1.4 仪器与设备  63-64
  4.2 方法  64-71
    4.2.1 鸽新城疫 F 基因原核表达载体的构建  64-68
      4.2.1.1 表达引物的设计  64
      4.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增  64
      4.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化  64-65
      4.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收  65-66
      4.2.1.5 目的片段与载体的连接  66
      4.2.1.6 感受态细胞的制备  66
      4.2.1.7 连接产物的转化  66-67
      4.2.1.8 重组质粒的提取  67
      4.2.1.9 重组质粒的鉴定  67-68
    4.2.2 重组菌的诱导表达与表达条件的优化  68-70
      4.2.2.1 重组菌的诱导表达  68
      4.2.2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析  68-69
      4.2.2.3 表达条件的优化  69
      4.2.2.4 包涵体蛋白的提取  69-70
    4.2.3 ELISA 方法的初步建立  70-71
      4.2.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定  70
      4.2.3.2 间接 ELISA 各工作条件的摸索  70-71
  4.3 结果  71-75
    4.3.1 重组表达载体的构建与鉴定  71-72
    4.3.2 融合蛋白的可溶性鉴定  72-74
      4.3.2.1 最佳诱导时间的确定  72-73
      4.3.2.2 最佳诱导温度的确定  73
      4.3.2.3 纯化蛋白的浓度  73-74
    4.3.3 ELISA 筛选方法的建立  74-75
      4.3.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定  74
      4.3.3.2 一抗作用时间的确定  74-75
      4.3.3.3 二抗作用时间的确定  75
      4.3.3.4 底物显色液作用时间的确定  75
  4.4 分析与讨论  75-77
  4.5 结论  77-78
第五章鸽新城疫 F 基因在毕赤酵母中的表达  78-87
  5.1 材料  78-80
    5.1.1 菌种和载体  78
    5.1.2 试剂和培养基  78
    5.1.3 培养基  78-79
    5.1.4 仪器与设备  79-80
  5.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-的构建  80-84
    5.2.1 引物的设计与合成  80-82
      5.2.1.1 目的基因的扩增  80
      5.2.1.2 胶回收目的基因  80
      5.2.1.3 目的基因与 pPIC9K 空载体的双酶切  80-81
      5.2.1.4 双酶切目的片段与 pPIC9K 空载体的电泳回收  81
      5.2.1.5 JM109 感受态细胞的制备  81
      5.2.1.6 目的基因与 pPIC9K 空载体的连接  81
      5.2.1.7 连接产物的转化  81
      5.2.1.8 重组表达质粒的提取与鉴定  81-82
    5.2.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-F 电转化毕赤酵母 GS115  82
      5.2.2.1 重组表达载体的线性化  82
      5.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备  82
      5.2.2.3 电激法转化  82
    5.2.3 高拷贝重组酵母菌株的筛选鉴定  82-83
      5.2.3.1 影印接种法筛选 G418 抗性菌株  82-83
      5.2.3.2 PCR 法鉴定重组菌株  83
    5.2.4 重组酵母菌株的诱导表达  83
    5.2.5 表达产物的 SDS-PAGE 分析  83-84
  5.3 结果与分析  84-85
    5.3.1 重组表达质粒 pPIC9K- PPMV-1-F 的 PCR 与双酶切鉴定  84-85
    5.3.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析  85
  5.4 讨论  85-86
  5.5 结论  86-87
第六章鸽新城疫 F 基因的真核表达分析及其生物活性研究  87-98
  6.1 材料  87-88
    6.1.1 菌种和载体  87
    6.1.2 试剂和培养基  87
    6.1.3 培养基  87-88
    6.1.4 仪器与设备  88
  6.2 方法  88-93
    6.2.1 鸽新城疫真核表达载体的构建  88-92
      6.2.1.1 表达引物的设计  88
      6.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增  88-89
      6.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化  89-90
      6.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收  90
      6.2.1.5 目的片段与载体的连接  90
      6.2.1.6 感受态细胞的制备  90-91
      6.2.1.7 连接产物的转化  91
      6.2.1.8 重组质粒的提取  91-92
      6.2.1.9 重组质粒的鉴定  92
    6.2.2 鸽新城疫真核表达质粒免疫原性研究  92-93
      6.2.2.1 免疫用重组质粒的制备与纯化  92-93
      6.2.2.2 动物基因免疫  93
      6.2.2.3 攻毒保护试验  93
  6.3 结果  93-95
    6.3.1 重组表达载体的构建与鉴定  93-94
    6.3.2 动物基因免疫  94-95
    6.3.3 攻毒保护试验  95
  6.4 分析与讨论  95-96
  6.5 结论  96-98
附录  98-110
致谢  110-111
参考文献  111-123
个人简介  123-124
导师简介  124-127

鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究

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