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奶牛乳房炎耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测及基因分型

作　者: 苏洋
导　师: 陈智华
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 奶牛乳房炎 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 mecA基因 SCCmec分型 spa分型 PVL毒力基因
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


奶牛乳房炎是阻碍奶牛养殖业发展最主要的奶牛疾病之一，导致严重的经济损失。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎主要病原微生物之一。近年来，越来越多不同动物源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现，特别是致病性牛源MRSA的出现，就意味着奶牛乳房炎面临着更为严峻的挑战。而国内有关牛源MRSA的报道鲜见。本研究旨在了解甘肃和上海地区乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药性、MRSA的分布情况及MRSA分离株的基因分型特点，为奶牛乳房炎的防治、乳房炎MRSA的流行监测提供理论依据。1采用K-B纸片扩散法，检测分离自甘肃和上海地区共69株临床型奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对8种常用抗菌药物的敏感性，用琼脂稀释法检测金黄色葡萄球菌的苯唑西林最小抑菌浓度（MICs）和万古霉素最小抑菌浓度（MICs）。菌株对庆大霉素、环丙沙星、四环素、头孢唑啉、万古霉素和苯唑西林的敏感性超过60%，且对万古霉素的敏感性高达100%；而对青霉素、磺胺异恶唑的耐药性分别达到95.7%和89.9%。2用头孢西丁纸片扩散法和PCR方法对受试菌株进行MRSA的检测。两种检测方法的结果不一致，PCR方法共检出28株（40.58%）mecA基因阳性菌株，其中17株（24.63%）OS-MRSA，11株（15.94%）MRSA；甘肃地区8株OS-MRSA，上海地区11株MRSA和9株OS-MRSA；头孢西丁纸片扩散法仅在上海地区检出16（23.19%）株MRSA且其中5株的苯唑西林MIC≤1μg/mL。3用PCR方法检测mecA基因阳性菌株的PVL毒力基因；用PCR方法扩增mecA基因阳性菌株spa基因的X区域，测序后根据数据库（http://www.ridom.de/spaserver/）进行分型；用多重PCR方法对mecA基因阳性菌株的SCCmec染色体盒进行基因分型。两种主要的基因型被分出，甘肃8株OS-MRSA、上海5株OS-MRSA和5株MRSA为spa t267、SCCmec typeⅤ,且都不携带PVL毒力基因；上海地区4株MRSA和4株OS-MRSA为spa t1234，SCCmec typeⅡ,且都不携带PVL毒力基因；2株上海地区MRSA分别为SCCmectypeⅡ和typeⅤ且都不携带PVL毒力基因，其spa基因型均未被分出。受试菌株的总体耐药情况较严重，首次从甘肃、上海地区的部分奶牛养殖场分离到OS-MRSA和MRSA，且感染率高。首次发现基因型为PVL毒力基因阴性、SCCmec typeⅤ、spa t267和PVL毒力基因阴性、SCCmec typeⅡ、spa t1234的乳房炎MRSA，这两种遗传背景的MRSA在在调查地区为主要流行菌株，且在世界范围内都少有报道，它们是否广泛存在于中国地区的奶牛养殖场，还需要进一步调查证实。由于OS-MRSA携带mecA耐药基因而对苯唑西林敏感，若在没检测mecA基因的情况下，这类菌株很可能在药敏试验中被错误分类为MSSA。根据本研究的结果和其它相关OS-MRSA的报道，警示在鉴定MRSA时应当用基因检测方法并结合表型检测方法。

全文目录


摘要  3-5
Summary  5-9
外文缩略词表  9-11
第一章 文献综述  11-23
  1 奶牛乳房炎的危害及病原  11-16
    1.1 奶牛乳房炎及其危害  11-12
      1.1.1 经济损失  11-12
      1.1.2 公共卫生安全  12
    1.2 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌概况  12-13
    1.3 MRSA 的流行现状  13-14
    1.4 MRSA 的耐药机制及分类  14-16
      1.4.1 MRSA 的耐药机制  14
      1.4.2 MRSA 的分类  14-16
  2 不同宿主来源 MRSA 的分子流行病学研究进展  16-23
    2.1 分型方法  16-18
      2.1.1 脉冲场凝胶电泳分型方法（PFGE）  16-17
      2.1.2 多位点序列分型（MLST）  17
      2.1.3 SCCmec 分型  17-18
      2.1.4 spa 基因分型  18
    2.2 MRSA 与寄主的关系  18-19
    2.3 MRSA 在动物中的流行概况  19-21
      2.3.1 MRSA 在宠物中的流行  19
      2.3.2 MRSA 在家畜中的流行  19-21
      2.3.3 MRSA 在家禽中的流行  21
    2.4 MRSA 在人与动物之间相互传播的情况  21-23
第二章 奶牛乳房炎中 MRSA 的检测  23-34
  1 材料与方法  23-26
    1.1 材料  23-25
      1.1.1 菌株  23-24
      1.1.2 抗菌药物  24
      1.1.3 培养基及主要试剂  24
      1.1.4 主要仪器设备  24-25
      1.1.5 mecA 基因引物  25
    1.2 试验方法  25-26
      1.2.1 药敏试验  25
      1.2.2 琼脂稀释法  25
      1.2.3 MRSA 的检测  25-26
  2 结果  26-31
    2.1 药敏试验  26-28
    2.2 MRSA 检测结果  28-31
      2.2.1 甘肃地区 MRSA 检测结果  28-29
      2.2.2 上海地区 MRSA 检测结果  29-31
  3 讨论  31-34
第三章 MRSA 的分子流行病学研究  34-43
  1 材料与方法  35-38
    1.1 材料  35-36
      1.1.1 菌株  35
      1.1.2 培养基及主要试剂  35
      1.1.3 主要仪器设备  35-36
    1.2 试验方法  36-38
      1.2.1 细菌基因组 DNA 的提取  36
      1.2.2 PVL 毒力基因检测  36
      1.2.3 spa 基因分型  36-37
      1.2.4 SCCmec 基因分型  37-38
  2 结果  38-41
    2.1 PVL 毒力基因检测结果  38
    2.2 spa 基因分型结果  38-39
    2.3 SCCmec 分型结果  39-41
      2.3.1 甘肃地区 SCCmec 分型结果  39-40
      2.3.2 上海地区 SCCmec 分型结果  40-41
  3 讨论  41-43
结论  43-44
参考文献  44-50
致谢  50-51
作者简介  51-52
导师简介  52-53

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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