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河南省H9 AIV、NDV和IBV的流行病学调查及H9 AIV HA、NA基因序列分析

作　者: 岳旭龙
导　师: 李新生
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒新城疫病毒鸡传染性支气管炎病毒 H9亚型流行病学 HA基因 NA基因
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

禽流感、新城疫和鸡传染性支气管炎是三种严重危害家禽养殖业的常见传染病。在世界许多地区流行,往往造成巨大经济损失。为了解河南省H9亚型禽流感、新城疫和鸡传染性支气管炎的流行情况。从河南省15个地市发病鸡场采集病鸡组织样品309份,采用鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,并利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和RT-PCR试验对分离毒株进行鉴定。结果表明,3类病毒的总检出率为26.54%,其中NDV、IBV和AIV(H9)的检出率分别为11.00%、3.88%和11.65%。2010年10月NDV和1BV检出率均最高,分别为30.00%、15.00%,2011年1月AIV(H9)检出率最高,为43.24%。2类病毒混合感染的检出率达3.24%。表明2010年7月—2011年4月H9亚型禽流感、新城疫以及鸡传染性支气管炎在河南省部分地区普遍流行,且存在一定程度的混合感染。对8株H9亚型禽流感病毒分离株HA、NA基因进行序列分析。结果表明8株分离株的HA基因片段均为1742bp,ORF全长1683bp,位置均为34-1716位核苷酸,均编码560个氨基酸。HA基因的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为92.8%～99.7%和94.7%-99.6%。NA基因片段均为1458bp, ORF全长1401bp,位置均为20-1420位核苷酸,均编码466个氨基酸。NA基因核苷酸及推导氨基酸同源性分别为93.1%-99.8和93.2%-99.8%。对禽流感病毒致病性、宿主选抒性相关氨基酸位点的分析显示,8株河南分离株在HA裂解位点处存在3种氨基酸排列顺序,分别为PSRSSR↓GLF、PSKSSR↓GLF和PVRSSR↓GLF,又有K和R为碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒裂解位点的氨基酸序列特征。HA基因受体结合位点第198位氨基酸DK/HK/Y280/97为T, XM-XQ1与CK/SH/F/98相同为A,其余分离株均为V。313位氨基酸AY-X19株为D,DK/HK/Y280/97、CK/SH/F/98和其他分离株均为N,315位氨基酸DK/HK/Y280/97、CK/SH/F/98和KF-XX5株为P,其余分离株均为S,这些变异导致除AY-X19株和KF-XX5株外,其余分毒株该处增加了一个糖基化位点;其中72位氨基酸SQ-X17株为N,其余毒株为T,变异导致SQ-X17株该处增加了一个糖基化位点;168位氨基酸JZ-X49株为T,导致该株在166位氨基酸增加了一个糖基化位点。所有分离株226位氨基酸为G,说明均为禽源禽流感病毒,其宿主范围均未发生变化,但234位氨基酸除XM-XQ1株为Q外其余均为L,呈现了人流感受体结合特性,可能进一步对人类公共卫生造成威胁。8个分离毒株NA茎部均存在第61、62和64位氨基酸N、I、E的缺失。NA蛋白中第86、146、200、234、402位氨基酸的糖基化位点高度保守,在神经氨酸酶的作用中至关重要。与DK/HK/Y280/97相比,除ZK-X1和AY-X19第45位氨基酸相对保守外,其余6株在该处增加一个糖基化位点；除XM-XQ1和KF-XX5第264位氨基酸相对保守外,其余6株在该处增加一个糖基化位点;SQ-X17由于第331位氨基酸改变,增加了一个糖基化位点；除XM-XQ1和KF-XX5第402位氨基酸相对保守外,其余6株均发生了改变导致该处糖基化位点的缺火。HA、NA基因系统进化树分析显示,8株河南分离株均属于欧亚谱系,HA基因进化关系最近的为DK/HK/Y280/97株,NA基因进化地位最近的为CK/SH/F/98株,且均属于以CK/BJ/1/94为代表的BeiJing-94分支,但各毒株的变异程度和进化地位有差异。这些结果为河南H9AIV、NDV和IBV的流行情况、鉴别诊断及防治提供技术依据。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-10
缩略词表  10-11
氨基酸的缩写符号  11-12
文献综述  12-25
  1 禽流感概述  12
  2 低致病性禽流感的危害  12-13
  3 流行病学  13-19
    3.1 H9亚型禽流感病毒的流行病学  13-14
      3.1.1 国内流行情况  13-14
      3.1.2 国外流行情况  14
    3.2 新城疫病毒的流行病学  14-16
      3.2.1 国内流行情况  14-16
      3.2.2 国外流行情况  16
    3.3 禽传染性支气管炎病毒流行病学  16-19
      3.3.1 国内流行情况  17-18
      3.3.2 国外流行情况  18-19
  4 禽流感病毒的分子生物学研究  19-25
    4.1 病毒粒子特征  19-20
    4.2 禽流感病毒HA、NA基因及编码蛋白的结构和功能  20-22
      4.2.1 HA基因  21-22
      4.2.2 NA基因  22
    4.3 禽流感病毒的遗传变异  22-25
      4.3.1 抗原性变异  22-24
        4.3.1.1 抗原漂移  23
        4.3.1.2 抗原转变  23-24
      4.3.2 致病性变异  24-25
引言  25-26
试验一 H9亚型AIV、NDV和IBV的流行病学调查  26-33
  1 材料和方法  26-27
    1.1 材料  26
      1.1.1 鸡胚、阳性血清  26
      1.1.2 主要仪器设备  26
      1.1.3 主要试剂  26
      1.1.4 IBV引物  26
      1.1.5 样品的采集  26
    1.2 试验方法  26-27
      1.2.1 样品的处理  27
      1.2.2 病毒的分离培养及纯化  27
      1.2.3 血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)  27
      1.2.4 IBV的RT-PCR鉴定  27
  2 结果与分析  27-30
    2.1 NDV、IBV和AIV(H9)总感染情况  27-28
    2.2 不同品种鸡群各病毒感染情况  28
    2.3 不同月份各病毒感染情况  28-29
    2.4 不同地区各病毒感染情况  29-30
    2.5 3种病毒混合感染情况  30
  3 讨论与结论  30-33
试验二 8株H9亚型AIV HA、NA基因的克隆及序列分析  33-51
  1 材料与方法  33-38
    1.1 材料  33-34
      1.1.1 毒株  33
      1.1.2 主要仪器  33
      1.1.3 主要试剂及试剂盒  33-34
      1.1.4 质粒与菌种  34
      1.1.5 试剂的配制  34
        1.1.5.1 琼脂糖电泳试剂的配制  34
        1.1.5.2 大肠杆菌转化用溶液  34
    1.2 试验方法  34-38
      1.2.1 病毒RNA的提取  34-35
      1.2.2 HA、NA基因的RT-PCR扩增  35-36
        1.2.2.1 CDNA第一链合成  35
        1.2.2.2 PCR扩增  35-36
      1.2.3 1%琼脂糖凝胶电泳  36
      1.2.4 8株河南分离毒株HA、NA基因克隆及鉴定  36-37
        1.2.4.1 RT-PCR产物的胶回收纯化  36
        1.2.4.2 PCR产物的连接  36
        1.2.4.3 连接产物的转化  36-37
        1.2.4.4 重组克隆的筛选  37
        1.2.4.5 重组质粒的提取  37
        1.2.4.6 重组质粒的酶切鉴定  37
      1.2.5 8株H9亚型禽流感病毒HA、NA基因核苷酸序列测定及序列分析  37-38
      1.2.6 8株H9亚型禽流感病毒HA、NA基因系统进化树分析  38
  2 结果与分析  38-48
    2.1 8株河南分离毒株HA、NA基因片段的RT-PCR扩增结果  38-39
    2.2 8株河南分离毒株HA、NA基因片段PCR产物胶回收纯化结果  39
    2.3 重组质粒的酶切鉴定及测序鉴定  39-40
    2.4 HA、NA基因序列测定及序列分析  40-47
      2.4.1 HA核苷酸序列和氨基酸分析  40-44
      2.4.2 NA基因分析  44-47
    2.5 系统进化树分析  47-48
  3 结论与讨论  48-51
全文总结  51-52
参考文献  52-62
英文摘要  62-64
附录一所分离病毒背景资料信息  64-67
附录二 8株分离株HA基因推导氨基酸序列比对  67-68
附录三 8株分离株NA基因推导氨基酸序列比对  68

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