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鸡弓形虫诊断抗原的筛选

作　者: 李锐
导　师: 李祥瑞
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡 弓形虫 诊断抗原 GRA8 间接ELISA
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


弓形虫病(toxoplasmosis)是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人兽共患寄生虫病,对于孕妇和免疫缺陷、免疫抑制者损害尤其严重。国内散养鸡的弓形虫感染率很高,平均在30%左右,被弓形虫感染的鸡体内会形成弓形虫包囊。生熟食未分开、食用未经充分烹调的鸡都有可能感染弓形虫。我国对散养鸡消费量很大,因此鸡弓形虫感染的检测对我国兽医公共卫生有着较重要的意义。禽畜弓形虫感染检测手段主要有病原学诊断、核酸检测和抗体检测技术三类方法。ELISA法有着采样简单,对检测设备要求低,检测结果敏感性高、特异性高的特点,是一种优良的检测手段。目前,市场上销售的鸡弓形虫抗体检测ELISA试剂盒存在抗体检出时间短,对感染后期抗体无法检出的缺点。这主要是由于这些试剂盒选用的弓形虫特异抗原效果不够好导致的。一些使用速殖子天然抗原制作的ELISA试剂盒更是存在特异性差、假阳性率高的问题。同时,国内外兽医研究单位对畜类弓形虫感染抗体检测技术研究较多,对禽类弓形虫感染检测研究较少,对鸡弓形虫感染检测的研究未见报道。为了增加禽类弓形虫特异性抗体的检测有效时间段和检测特异性,本实验通过Western blot、双向电泳、MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定相结合的方法筛选到了适宜的鸡弓形虫感染诊断抗原GRA8并进行了原核表达以及ELISA检测效果验证。本研究按照本实验室的赵光伟博士建立的弓形虫人工感染模型,给25只14日龄雏鸡腹腔注射107弓形虫速殖子,并采集了0-139d的感染鸡血清作为一抗,与弓形虫全虫蛋白进行了免疫印迹,筛选到了38KD和35KD两条抗原蛋白条带。在人工感染后7-95d,这两个蛋白条带与大多数感染鸡血清结合,在免疫印迹中呈强阳性反应。针对此分子量区域的蛋白,将大量全虫蛋白进行制备胶SDS-PAGE,参照预染Marker切下35-38KD的抗原蛋白条带,进行透析袋内的电洗脱回收和蛋白浓缩。分离到35-38KD蛋白,进行双向电泳,将电泳结果同时进行胶体考马斯染色和Western blot。根据Western blot结果切取染色胶上有阳性反应的抗原蛋白点,进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,确定了2个抗原候选蛋白：Porin和GRA8.以弓形虫速殖子cDNA为模板,根据NCBI上Porin和GRA8的mRNA序列设计引物,使用RT-PCR的方法扩增出了Porin和GRA8的ORF全长序列,克隆到原核表达载体pET-28a中,并转入大肠埃希氏杆菌BL21菌株进行IPTG诱导表达,His亲和层析,得到了较高纯度的Porin重组蛋白(rPorin)和GRA8重组蛋白(rGRA8)。使用14-45d感染鸡血清与重组蛋白进行Western blot, rPorin蛋白未见明显阳性反应,rGRA8蛋白呈强阳性反应,由于蛋白纯度高,rGRA8Western blot反应强度比弓形虫全虫蛋白大。使用rPorin和rGRA8蛋白包被ELISA板条,与4-128d感染鸡血清进行间接ELISA反应,rPorin蛋白ELISA结果中阳性血清孔与阴性血清孔差异不显著,证明rPorin无鸡弓形虫感染血清学诊断价值,rGRA8蛋白阴性与阳性孔差异明显,具有诊断价值。经过抗原包被量、一抗二抗浓度等反应条件的优化后,以rGRA8为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法在感染后7-28d对人工感染鸡的检测敏感性达到100%,45d内达到95%以上,63d内达到90%以上,139d内达到85%以上。特异性方面,用rGRA8蛋白检测鸡球虫(柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫),鸡大肠杆菌,禽流感病毒(H5型、H9型),鸡新城疫病毒,鸡法氏囊病毒等常见病原体感染血清均无交叉反应。该方法检测敏感性高,特异性高,是一个良好的鸡弓形虫感染诊断抗原,它的推广使用对于人畜共患的弓形虫病防控具有积极意义。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
前言  12-15
  参考文献  14-15
第一章 文献综述  15-29
  1 弓形虫简介  15-17
    1.1 弓形虫的生活史  15-16
    1.2 弓形虫不同形态对环境的抵抗力  16-17
    1.3 获得性弓形虫病的传播方式  17
  2 弓形虫病对人的危害  17-19
    2.1 先天性弓形虫病  18
    2.2 免疫缺陷者和免疫抑制者的获得性弓形虫病  18
    2.3 正常成人的弓形虫感染  18-19
  3 散养鸡在人弓形虫传播中的地位  19-20
  4 弓形虫感染的常见诊断方法  20-23
    4.1 病原学诊断方法  20
    4.2 分子生物学诊断方法  20-21
    4.3 血清学诊断方法  21-23
  5 弓形虫感染ELISA抗体诊断方法研究现状以及ELISA诊断试剂盒质量现状  23-25
    5.1 弓形虫速殖子抗原研究情况  23-24
    5.2 国内市售ELISA诊断试剂盒质量现状  24-25
  参考文献  25-29
第二章 Western blot筛选鸡弓形虫感染诊断抗原  29-41
  摘要  29
  1 实验材料  29
  2 主要仪器  29
  3 主要试剂及其配制  29-31
  4 实验方法  31-33
    4.1 弓形虫的扩增和纯化  31
    4.2 鸡弓形虫人工感染模型的建立和血清采集  31-32
    4.3 速殖子全虫蛋白的提取  32
    4.4 全虫蛋白的SDS-PAGE  32
    4.5 全虫蛋白的Western blot  32-33
  5 实验结果  33-39
    5.1 全虫蛋白的SDS-PAGE  33
    5.2 全虫蛋白的Western blot  33-39
  6 讨论  39-40
  参考文献  40-41
第三章 38KD抗原蛋白切胶回收和双向电泳分离鉴定  41-49
  摘要  41
  1 材料  41
  2 主要仪器  41
  3 主要试剂耗材  41-42
  4 方法  42-45
    4.1 蛋白切胶回收和样品制备  42-43
    4.2 双向电泳分离  43-44
    4.3 Western blot分析  44
    4.4 凝胶蛋白点的切取和MALDI-TOF-TOF检测  44-45
  5 实验结果  45-46
    5.1 38KD抗原蛋白双向电泳和Western blot结果  45-46
    5.2 MALD1-TOF-TOF质谱鉴定结果  46
  6 讨论  46-48
  参考文献  48-49
第四章 GRA8蛋白以及Porin蛋白的原核表达  49-65
  摘要  49
  1 材料、菌种和载体  49
  2 主要仪器  49-50
  3 主要试剂耗材  50
  4 方法  50-57
    4.1 弓形虫的扩增与纯化  50
    4.2 弓形虫总RNA的提取和cDNA的合成  50-51
    4.3 基因的RT-PCR扩增  51-52
    4.4 基因的克隆与表达  52-56
    4.5 重组蛋白抗原性的Western blot验证  56
    4.6 重组蛋白抗原性的ELISA验证  56-57
  5 实验结果  57-63
    5.1 基因的PCR扩增  57
    5.2 pMD18T-GRA8与pMD18T-Porin的构建  57-58
    5.3 pET28a-Porin 与 pET28a-GRA8 的构建  58-59
    5.4 重组蛋白的诱导表达  59-60
    5.5 重组蛋白的组氨酸亲和层析纯化  60-61
    5.6 重组蛋白rGRA8与rPorin抗原性的Western blot结果  61-62
    5.7 重组蛋白rPorin抗原性的ELISA检验  62-63
  6 讨论  63-64
  参考文献  64-65
第五章 GRA8-ELISA检验条件的建立和效果验证  65-75
  摘要  65
  1 材料、菌种和载体  65
  2 主要仪器  65-66
  3 主要试剂耗材  66
  4 实验方法  66-68
    4.1 GRA8-ELISA最佳工作条件的确定  66-67
    4.2 间接ELISA测定的基本实验步骤  67
    4.3 ELISA阴阳性界限的确定  67-68
    4.4 弓形虫感染后不同时间血清抗体检出灵敏度的确定  68
    4.5 交叉反应实验  68
  5 实验结果  68-72
    5.1 抗原最佳包被浓度和—抗血清最佳稀释度的确定(方阵滴定)  68-69
    5.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定  69
    5.3 TMB最佳显色时间的确定  69-70
    5.4 ELISA阴阳性界限的确定  70
    5.5 弓形虫感染后不同时间血清抗体检出灵敏度的确定  70-72
    5.6 交叉反应实验  72
  6 讨论  72-75
全文总结  75-77
致谢  77-79
附录  79-80

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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