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人源福氏志贺菌对鸡肠上皮细胞侵袭特性及其机制研究

作　者: 师润
导　师: 陈陆
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 人源福氏志贺菌鸡肠上皮原代细胞侵袭细胞信号转导细胞骨架
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

众多研究报道指出，志贺菌的宿主为人和非人灵长类动物。近些年，国内外有志贺菌感染实验猴、家兔、犊牛和仔猪的临床报道。许兰菊、王川庆等于2004年首次报道了鸡志贺菌病例，主要以雏鸡脓血痢为特征。对中国部分地区有腹泻病史的鸡群进行血清流行病学调查发现，志贺菌抗体阳性率达28.3%～33.7%，说明鸡志贺菌感染已成为中国鸡群腹泻疾病的重要病因之一。病原学研究发现，鸡源志贺菌在生物学及血清学特性等方面与人源志贺菌完全相同。从基因水平上看，鸡源志贺菌与人源志贺菌高度同源，可能起源于人源志贺菌，或是人源志贺菌新的亚种。在交互感染方面，我们以人源鲍氏志贺菌、人源福氏志贺菌进行雏鸡感染试验，组织免疫组化和电镜结果检测人源志贺菌能侵入鸡肠道上皮细胞，证明人源志贺菌能感染鸡，且人源福氏志贺菌致病性最强。这一发现预示着公共卫生和人类健康又面临新的挑战。为研究人源志贺菌对鸡致病性和相关侵袭特性提供体外模型，本研究建立了鸡肠上皮原代细胞分离培养方法。分别取不同日龄鸡胚，采用0.1g/mLⅠ型中性蛋白酶和300U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞，筛选鸡肠上皮原代细胞最佳培养方法，并对培养细胞进行鉴定。然后采用0.125%胰酶和0.01%EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代。应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果，细胞贴壁性良好。培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞，培养的细胞在12h内贴壁生长，24-48h明显增殖，72h后细胞增殖速度减慢，生长状况不良。经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞。且传代后细胞贴壁生长良好。制备的细胞可以连续传代3代。建立鸡肠上皮原代细胞分离培养方法，可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞。为进一步验证人源志贺菌对鸡的致病性并建立体外研究模型，采用Hela细胞庆大霉素保护试验和免疫组织化学染色检测分离的人源福氏志贺菌ZD02株的侵袭毒力。然后采用细胞免疫组织化学染色研究ZD02株对鸡肠上皮细胞的侵袭力和相关侵袭特性。人源福氏志贺菌ZD02株能够侵入Hela细胞，庆大霉素保护试验结果显示，感染后30、60、90、120min时ZD02株侵袭率分别为1.43%、2.43%、2.56%、2.62%，证明ZD02株具有侵袭毒力。ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞免疫组织化学检测结果显示，ZD02株能侵入鸡肠上皮细胞，感染后1、2、3、4h时ZD02株侵袭率分别为1.7%、6.2%、8.0%、11.2%。鸡肠上皮原代细胞经EGTA处理后，ZD02株侵袭率显著提高。结果证明人源福氏志贺菌ZD02株对鸡肠上皮细胞具有侵袭力，且从肠上皮细胞基底侧部侵袭。本研究进一步证明人源志贺菌对鸡肠上皮细胞的侵袭特性，具有人禽互传的可能性，鸡肠上皮原代细胞可作为研究志贺菌致病机理的体外模型。为研究细胞信号转导和骨架在人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮细胞中的作用。分别用酪氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白磷酸酶、蛋白激酶C、Ca²⁺通道等信号转导抑制剂染料木黄酮、原钒酸钠、星状孢子素、硝苯地平和微丝蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B处理鸡肠上皮原代细胞后，采用细胞免疫组织化学染色检测人源福氏志贺菌ZD02株对鸡肠上皮原代细胞侵袭率，用间接免疫荧光双重标记检测ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞后F-肌动蛋白分布的变化。染料木黄酮、硝苯地平和细胞松弛素B能显著抑制人源福氏志贺菌ZD02株内化，星状孢子素和原钒酸钠对ZD02株的内化无影响，人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞时F-肌动蛋白发生聚集。人源福氏志贺菌ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞过程中需要酪氨酸蛋白激酶、Ca²⁺通道活化以及细胞微丝重排。综上结果可知，人源福氏志贺菌对鸡肠上皮细胞具有一定的侵袭力，并且从肠上皮细胞基底侧部侵袭，侵袭过程需要酪氨酸蛋白激酶、Ca²⁺通道活化以及细胞微丝重排。

全文目录

致谢  5-7
摘要  7-9
英文缩略表  9-10
文献综述  10-18
  第一章肠上皮原代细胞培养研究进展  10-13
  第二章志贺菌致病的分子机制  13-18
试验研究  18-44
  试验一鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定  18-26
    摘要  18
    1 材料与方法  18-19
    2 结果  19-24
    3 讨论  24-26
  试验二人源福氏志贺菌对鸡肠上皮原代细胞侵袭特性研究  26-36
    摘要  26-27
    1 材料与方法  27-28
    2 结果  28-34
    3 讨论  34-36
  试验三细胞信号转导和骨架在人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞中的作用  36-44
    摘要  36
    1 材料和方法  36-38
    2 结果  38-41
    3 讨论  41-44
参考文献  44-50
ABSTRACT  50-52
附表一：作者简介及读研期间已发表文章  52

人源福氏志贺菌对鸡肠上皮细胞侵袭特性及其机制研究

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