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奶山羊泌乳相关miRNA鉴定及miR-2478调控机制解析

作　者: 李转见
导　师: 陈宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 奶山羊 乳腺组织 泌乳生理 miRNA miR-2478 调控机制
分类号: S827
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


miRNA参与基因转录表达调控,在动物生长发育、激素分泌和乳汁分泌等生理过程中发挥重要作用。乳腺是哺乳动物的泌乳器官。泌乳性状是奶山羊最重要的经济性状,与乳腺组织紧密相关。为此,本研究利用新一代高通量测序、定量PCR、基因克隆以及细胞转染等实验技术结合生物信息学分析来筛选奶山羊泌乳相关miRNA,并对候选miRNA做进一步的功能研究。内容包括构建奶山羊乳腺组织小RNA文库,鉴定泌乳高峰期和干奶期乳腺组织中保守miRNA和新miRNA,筛选这两个时期乳腺组织中差异表达的miRNA并进行组织表达谱分析,验证miR-2478的靶基因及其调控靶基因的机制,最后还研究了候选miRNA和PrRP基因遗传变异效应,本研究主要取得了以下结果：1、奶山羊乳腺组织小RNA测序及miRNA的鉴定分析利用新一代高通量测序技术构建了西农萨能奶山羊泌乳高峰期与干奶期乳腺组织的小RNA文库,分别得到大于18nt的clean读数15,712,891和14,851,375条。在长度分布上,21-23nt的小RNA序列数在干奶期乳腺组织中占总序列数的70%以上,而在泌乳高峰期乳腺组织库中占总序列数的约40%。共鉴定了346个保守成熟miRNA和95个新miRNA。其中,泌乳高峰期乳腺组织中发现了303个保守miRNA和54个新]miRNA,在干奶期乳腺组织中发现了337个保守miRNA和76个新miRNA。在总数、长度分布和种类上乳峰期与干奶期乳腺组织小RNA有显著的差异。表明miRNA在乳腺组织中有明显的时序性和动态变化。2、奶山羊乳腺组织miRNA的验证分析利用PCR和stem-loop PCR的方法分别对山羊miRNA前体序列和miRNA成熟体进一步克隆验证。克隆了随机选取的20个保守miRNA和9个高表达的新miRNA。结果表明牛和山羊的miRNA成熟体和前体序列高度保守。序列和结构的高度同源表明miRNA的功能在同源物种间也可能相似或相同。同时也表明以牛的基因组和miRNA数据库为参考分析山羊乳腺组织中的miRNA是可行的。3、泌乳生理相关miRNA的筛选、表达谱及功能分析与干奶期乳腺组织中miRNA相比,在泌乳高峰期乳腺组织中共筛选出169个差异表达的保守miRNA,其中显著下调的有161个,显著上调的有8个。利用实时定量PCR对13个保守miRNA和9个新miRNA进行组织表达谱分析,保守miRNA没有明显的组织特异性,且大都在肌肉和肝脏中也高表达。而新miR12呈现乳腺组织特异性。与其它物种的miRNA数据比较分析发现,let-7家族的miRNA几乎在所有物种中都高丰度表达。miR-21, miR-30a, miR-101, miR-103, miR-107和miR-148a在人、小鼠、鸡、猪和牛中序列高度保守且都以高丰度表达。乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA的比较结果表明：两者的miRNA有近一半是相同的且多与免疫相关。我们推测乳汁中与免疫相关的miRNA可能是由乳腺上皮细胞主动分泌到泌汁中,从而为新生个体的免疫系统发育提供调节因子。预测的靶基因GO和KEGG分析表明乳腺中miRNA的靶基因主要涉及了胰岛素信号转导通路、JAK-STAT信号转导通路、TGFβ信号转导通路、mTOR信号通路和MAPK通路上等能量代谢、泌乳生理和乳蛋白合成相关的信号通路。并高度富集到细胞分裂、代谢、生物学调节、发育和解剖结构发育等过程。4、miR-2478靶基因的预测与验证分析利用生物信息学方法预测了miR-2478的靶基因,并筛选了SRA1、FBXO11、NCOR1、 TGFβ1、ING4.ING2和INSR等7个潜在的靶基因,克隆相应山羊基因分析发现FBXO11、 TGFβ1、ING4和INSR基因上靶位点序列与参考序列相同。对这4个靶基因进一步双荧光素酶报告检测系统检测,结果表明miR-2478的模拟物只与预测的TGFβ1基因的5’UTR为靶位点发生作用,且预测的TGFβ1基因上靶位点缺失后调节效应也相应解除。结果表明,TGFβ1基因是miR-2478的靶基因。5、miR-2478对TGFβ1基因调控机制分析对TGFβ1基因的启动子实验分析表明该基因有两个主要的转录活性区,分别位于904～-690bp和-79～+197bp。通过生物信息学预测的启动子区域与试验得到的结论基本重叠,进一步分析发现-904～-690和-79～+197bp区域中存在丰富的转录因子结合位点,并且这两个区域存在长约850bp的CpG岛。miR-2478的作用在TGFβ1基因下游启动子区(Downstream Promoter Element, DPE),此外miR-2478的种子区与靶序列结合位点TGGG处存在一个转录因子RBPJ的结合位点。表明miR-2478是通过作用TGFβ1基因下游启子区来调控该基因的转录表达。6、泌乳相关miRNA和靶基因遗传变异分析利用DNA池测序的方法扫瞄了20个miRNA遗传变异,发现了miR-431的-217位C>T的突变,miR-196a的107位C>T的突变和miR-2478成熟体上12-13位CT缺失突变。其中,miR-431的TT基因的个体第三胎泌乳量显著高于其它个体的(P<0.05),miR-196a的第二,三胎杂合型个体的泌乳量显著高于TT基因型个体的(P<0.05)。通过体外实验表明：miR-2478成熟体上两个碱基“UC”缺失,降低了与靶基因TGFβ1的作用效应,但突变后仍有一定的调控作用。此外,还发现4个PrRP基因多态位点,1150G>A,1242T>C,1413A>G和1677indel22bp,其中1242T>C,1413A>G处于完全连锁状态。单倍型HlHl对体长和胸围影响有极其显著正效应(P<0.01)。单倍型H1H1可以作为一个分子标记进一步应用于奶山羊的育种实践中。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-16
引言  16-17
第一章 文献综述  17-33
  1.1 山羊乳腺发育与泌乳研究进展  17-22
    1.1.1 羊奶与人类的营养  17
    1.1.2 乳腺发育与乳的形成  17-18
    1.1.3 泌乳相关重要调控基因和调控通路  18-22
  1.2 miRNA特征及作用机制  22-27
    1.2.1 miRNA的发现及生物学合成  22-23
    1.2.2 miRNA的生物学作用机制  23-24
    1.2.3 miRNA的靶基因鉴定方法  24-25
    1.2.4 miRNA与lncRNA  25-27
  1.3 miRNA在家畜育种的研究进展  27-29
  1.4 miRNA遗传变异的效应  29-30
  1.5 乳品中miRNA的研究  30-31
  1.6 本研究的目的意义  31-33
第二章 奶山羊乳腺组织小RNA测序及miRNA的鉴定  33-50
  2.1 材料与方法  33-37
    2.1.1 试验动物及组织样品的采集  33
    2.1.2 RNA的提取与质量检测  33-34
    2.1.3 小分子RNA的cDNA文库构建  34-35
    2.1.4 文库的检测和高通量测序  35-36
    2.1.5 测序结果生物信息学分析  36-37
  2.2 结果与分析  37-47
    2.2.1 总RNA提取和检测结果  37-38
    2.2.2 小RNA文库的Solexa测序  38-39
    2.2.3 小RNA的生物信息学分析  39-43
    2.2.4 保守miRNA和新miRNA的鉴定  43-47
  2.3 讨论  47-49
    2.3.1 关于miRNA的鉴定方法  47
    2.3.2 泌乳中期与干奶期乳腺组织中小RNA文库的差异  47-48
    2.3.3 保守miRNA  48
    2.3.4 新的候选miRNA  48-49
  2.4 小结  49-50
第三章 奶山羊乳腺组织miRNA的验证研究  50-62
  3.1 材料与方法  50-56
    3.1.1 试验动物及组织样品的采集  50
    3.1.2 RNA的提取与cDNA的合成  50-51
    3.1.3 miRNA的选取和引物设计  51-54
    3.1.4 山羊miRNA前体序列PCR克隆与测序  54-55
    3.1.5 山羊miRNA前体序列分析  55-56
    3.1.6 山羊miRNA分子的克隆与检测  56
  3.2 结果与分析  56-60
    3.2.1 pre-miRNA山羊与牛序列同源性比较  56
    3.2.2 山羊pre-miRNA二级结构信息分析  56-59
    3.2.3 山羊miRNA分子的克隆鉴定  59-60
  3.3 讨论  60-61
    3.3.1 牛和山羊的序列同源性  60
    3.3.2 miRNA同源物种间的保守性  60-61
    3.3.3 miRNA分子检测  61
  3.4 小结  61-62
第四章 乳腺生理相关miRNA的筛选、功能预测及表达谱分析  62-84
  4.1 材料与方法  63-66
    4.1.1 试验动物及组织样品的采集  63
    4.1.2 RNA的提取与cDNA的合成  63
    4.1.3 筛选差异表达miRNA分析  63
    4.1.4 miRNA的stem-loop RT-PCR定量分析  63-65
    4.1.5 比较各物种中高表达miRNA异同  65
    4.1.6 比较乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA异同  65
    4.1.7 miRNA靶基因的预测  65-66
    4.1.8 靶基因的功能注释  66
  4.2 结果与分析  66-78
    4.2.1 miRNA差异表达分析  66-68
    4.2.2 差异表达的miRNA时空表达分析  68-73
    4.2.3 各物种中高表达miRNA比较  73-74
    4.2.4 乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA的比较  74-75
    4.2.5 miRNA靶基因分析  75
    4.2.6 靶基因的GO和Pathway分析  75-78
  4.3 讨论  78-83
    4.3.1 差异miRNA的比较分析  78-79
    4.3.2 各物种中高表达miRNA比较分析  79-80
    4.3.3 乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA比较分析  80-81
    4.3.4 miRNA靶基因分析  81-82
    4.3.5 靶基因功能分析  82-83
  4.4 小结  83-84
第五章 奶山羊miR-2478靶基因的初步鉴定  84-104
  5.1 材料与方法  85-92
    5.1.1 试验材料  85
    5.1.2 乳腺组织总RNA提取及cDNA的合成  85
    5.1.3 靶基因的预测  85
    5.1.4 靶基因对应山羊序列的扩增与验证  85-86
    5.1.5 靶序列野生型与突变型psiCHECK-2载体构建  86-90
    5.1.6 HEK293T细胞培养与传代培养  90-91
    5.1.7 HEK293T细胞的转染  91
    5.1.8 双荧光素酶报告检测  91
    5.1.9 统计分析  91-92
  5.2 结果与分析  92-101
    5.2.1 靶基因的预测  92-93
    5.2.2 对应山羊靶基因序列的扩增与比对  93-94
    5.2.3 野生型psiCHECK-2载体构建与鉴定  94-96
    5.2.4 突变型psiCHECK-2载体构建与鉴定  96-97
    5.2.5 psiCHECK-2载体测序验证  97
    5.2.6 HEK293T细胞培养转染  97-98
    5.2.7 不同靶序列与miR-2478作用验证结果  98-101
  5.3 讨论  101-103
    5.3.1 miRNA靶基因的预测方法  101
    5.3.2 Overlap PCR定点突变基因的方法  101-102
    5.3.3 miRNA靶基因的验证  102-103
  5.4 小结  103-104
第六章 miR-2478靶向TGFβ1基因机制分析  104-112
  6.1 材料与方法  104-106
    6.1.1 试验材料  104
    6.1.2 TGFβ1基因5’侧翼区系列缺失载体的构建  104-105
    6.1.3 HEK293T细胞培养与传代培养  105
    6.1.4 HEK293T细胞的转染  105
    6.1.5 双荧光素酶报告检测  105
    6.1.6 统计分析  105
    6.1.7 TGFβ1基因5’侧翼区的生物信息学分析  105-106
  6.2 结果与分析  106-110
    6.2.1 TGFβ1基因5’侧翼区系列缺失载体的构建及鉴定  106-107
    6.2.2 TGFβ1基因5’侧翼区系列缺失质粒转录活性测定  107-108
    6.2.3 TGFβ1基因5’侧翼区转录调控位点分析  108-109
    6.2.4 TGFβ1基因5’侧翼区甲基化分析  109
    6.2.5 TGFβ1基因启动子特征序列分析  109-110
  6.3 讨论  110-111
    6.3.1 miRNA靶向5’UTR和CDS区  110
    6.3.2 TGFβ1基因启动子的调控模式  110-111
  6.4 小结  111-112
第七章 泌乳相关miRNA和相关基因遗传变异研究  112-124
  7.1 材料与方法  112-114
    7.1.1 试验材料  112-113
    7.1.2 主要试剂和仪器  113
    7.1.3 DNA提取和DNA池测序扫描基因的多态性  113
    7.1.4 PCR-RFLP检测突变在群体中的分布  113
    7.1.5 miR-2478突变体与靶序列互作分析  113-114
    7.1.6 数据处理  114
  7.2 结果与分析  114-121
    7.2.1 山羊基因组DNA样品的检测  114-115
    7.2.2 多态的筛选与鉴定  115
    7.2.3 多态的PCR-RFLP或PCR检测  115-118
    7.2.4 遗传变异的关联分析  118-120
    7.2.5 miR-2478突变体与靶序列互作分析  120-121
  7.3 讨论  121-123
    7.3.1 PrRP,miR-196a,miR-431和miR-2478基因变异效应  121-122
    7.3.2 miR-2478成熟体的突变对靶基因的效应分析  122-123
  7.4 小结  123-124
第八章 结论与创新点  124-126
  8.1 结论  124-125
  8.2 创新点  125
  8.3 进一步的研究内容  125-126
参考文献  126-139
附录  139-148
致谢  148-149
作者简介  149

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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