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TMV、PVM和CMV干扰载体构建及对人参果的遗传转化

作　者: 高宜峰
导　师: 张金文
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 烟草花叶病毒 马铃薯M病毒 黄瓜花叶病毒 ihpRNA 遗传转化
分类号: S668.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


人参果是以营养器官繁殖为主的多年生草本植物，连年种植容易造成多种病毒病积累。为了培育同时抵御多种病毒病的人参果转基因植株，本试验以危害人参果的主要病毒烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯M病毒和黄瓜花叶病毒（CMV）为对象，筛选靶标序列，用重叠延伸PCR方法将三个靶标片段融合在一起，构建了3种病毒基因靶标片段融合基因的植物ihpRNAi载体。1. TMV、PVM和CMV靶标片段的选择与克隆。根据GenBank中烟草花叶病毒（TMV）P126基因[GI:371786069]、马铃薯M病毒（PVM）CP基因[GI:361071296]和黄瓜花叶病毒（CMV）2b蛋白基因[GI:83282715]序列，通过E-RNAi网站在线分析，筛选出TMV P126基因片段、PVM CP基因片段和CMV2b蛋白基因片段，这些片段含有较多有效小干扰RNA[siRNA，19nt]的长dsRNA片段，可作为构建干扰载体的目的片段。2.靶标片段的融合及反向重复表达载体的构建。采用重叠延伸PCR技术（splicing-by-overlap extension PCR，SOE-PCR），首先构建融合基因PC和TPC（正向插入片段F），再扩增反向插入片段R。然后将正向片段TPC（F）和反向片段分别插入载体pHANNIBAL所含内含子（intron）两侧，获得重组质粒pHAIFR，再将含intron的正反向片段整体酶切后插入载体pCEPSPS，最终得到含融合基因TPC反向重复的植物表达载体pCEIHFR。3.人参果的遗传转化。将pCEIHFR通过冻融法导入农杆菌LBA4404，采用叶盘法转化人参果，获得了人参果再生植株，为后续实验奠定了基础。并验证了人参果叶盘法遗传转化体系中最佳的激素组合为ZT和IAA。

全文目录


摘要  3-4
Summary  4-5
缩略词表  5-8
Ⅰ 引言  8
Ⅱ 文献综述  8-19
  1 人参果的生产和研究现状  8-9
  2 TMV、PVM 和 CMV 的研究现状  9-12
    2.1 烟草花叶病毒（TMV）的生物学特性与基因组结构特征  9-10
      2.1.1 烟草花叶病毒的生物学特性  9
      2.1.2 烟草花叶病毒基因组的结构与功能  9-10
    2.2 马铃薯 M 病毒（PVM）的生物学特性与基因组结构特征  10-11
      2.2.1 马铃薯 M 病毒的生物学特性  10
      2.2.2 马铃薯 M 病毒基因组的结构与功能  10-11
    2.3 黄瓜花叶病毒（CMV）生物学特性与基因组结构特征  11-12
      2.3.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性  11-12
      2.3.2 黄瓜花叶病毒基因组的结构与功能  12
  3 植物抗病毒基因工程研究进展及 RNAi 技术在植物抗病毒中的应用  12-19
    3.1 植物抗病毒基因工程研究进展  12-13
    3.2 植物中 RNAi 的沉默通路及 RNAi 技术在植物病毒防治中的作用  13-15
      3.2.1 植物中 RNAi 的沉默通路  13-15
      3.2.2 RNAi 在植物病毒病防治中的作用  15
    3.3 植物病毒 RNA 沉默抑制子种类及对基因沉默抑制的作用机制  15-17
    3.4 RNAi 载体结构与沉默效果关系  17-18
    3.5 siRNA 设计网站  18-19
Ⅲ 研究的目的意义  19-20
Ⅳ 研究技术路线  20-21
Ⅴ 材料与方法  21-32
  1 材料  21-23
    1.1 菌种和质粒  21
    1.2 病样采集  21
    1.3 工具酶和试剂  21
    1.4 主要仪器设备  21
    1.5 培养基  21-23
      1.5.1 细菌培养基  21-22
      1.5.2 人参果组织培养培养基与遗传转化培养基  22
      1.5.3 MS 培养基母液配制注意事项  22-23
    1.6 植物激素  23
    1.7 IPTG 和 X-Gal  23
    1.8 抗生素  23
  2 试验方法  23-32
    2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  23
    2.2 大肠杆菌感受态细胞的转化  23-24
    2.3 大肠杆菌质粒 DNA 的提取  24-25
    2.4 靶标片段的克隆  25-26
      2.4.1 靶标片段的选择及引物设计  25-26
      2.4.2 人参果病叶总 RNA 的提取及反转录  26
      2.4.3 三个靶标片段扩增  26
    2.5 靶标片段融合以及反向插入片段合成  26-28
      2.5.1 两个靶标片段融合  26-27
      2.5.2 三个靶标片段融合  27-28
      2.5.3 反向插入片段扩增  28
    2.6 RNAi 中间载体的构建  28-29
      2.6.1 正向片段插入载体 pHANNIBAL  28
      2.6.2 反向片段插入载体 pHAIF  28-29
    2.7 RNAi 表达载体的构建  29-30
    2.8 遗传转化  30-32
      2.8.1 农杆菌感受态细胞的制备  30
      2.8.2 表达载体转化农杆菌  30
      2.8.3 农杆菌工程菌的鉴定  30-31
      2.8.4 农杆菌介导的人参果遗传转化  31-32
Ⅵ 结果与分析  32-40
  1 三个靶标片段克隆  32-34
    1.1 TMV 靶标片段克隆及序列分析  32
    1.2 PVM 靶标片段克隆及序列分析  32-33
    1.3 CMV 靶标片段克隆及序列分析  33-34
  2 三个靶标片段融合以及反向插入片段扩增  34-37
  3 RNAi 中间载体 pHAIFR 和表达载体 pCEIHFR 的构建  37-39
    3.1 RNAi 中间载体 pHAIFR 的构建  37
      3.1.1 正向片段插入 pHANNIBAL 质粒  37
      3.1.2 反向片段插入 pHANNIBAL 质粒  37
    3.2 RNAi 表达载体 pCEIHFR 的获得  37-38
    3.3 RNAi 表达载体 pCEIHFR 转化农杆菌及其鉴定  38-39
  4 转化再生苗的获得  39-40
Ⅶ 讨论  40-42
结论  42-43
参考文献  43-52
附表  52-56
致谢  56-57
导师简介  57-58
作者简介  58-59

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 其他
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