学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

乙烯调控早熟苹果果实软化和裂果机理的初步研究

作　者: 李敏
导　师: 陈学森
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果果实 乙烯 软化和裂果 脱落 ZMdERFs ZMdEILs ZMdPG1
分类号: S661.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 63次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


由硬度和脆度构成的果实质地品质是苹果品质的重要构成因素之一。它不仅影响苹果的鲜食品质，也是限制苹果贮运品质的重要因素。因此探讨苹果质地品质形成的机理也具有重要的意义。本课题组育成的早熟苹果新品种‘泰山早霞’综合经济性状优良，但依然存在果实容易软化变绵这一早熟苹果的共性问题，特别是全红期采收的果实在室温条件下存放3～5d后就软化变绵甚至裂果，严重影响了苹果的品质。因此研究早熟果实质地品质的形成机理，改善早熟苹果果实质地品质是当前培育优质早熟苹果品种急需解决的问题。本文以‘泰山早霞’苹果为试材，分别测定果实生长发育期和贮藏期以及采后用乙烯抑制剂1-MCP处理果实的内源乙烯合成，PG酶活性和果实硬度的变化。克隆了五个乙烯信号转导途径的调控基因（ZMdEIL1、ZMdEIL2、ZMdEIL3、ZMdERF1和ZMdERF2）和一个功能基因ZMdPG1，并研究乙烯信号调控基因和ZMdPG1在苹果果实生长发育和成熟软化过程中的表达模式，以及对1-MCP（1.0μl·L-1）处理的应答模式，鉴别参与苹果果实成熟软化的重要基因；验证乙烯信号转导途径调控基因和功能基因ZMdPG1的作用；初步探索乙烯信号编码基因对功能基因ZMdPG1的调控作用，明确乙烯与苹果果实软化和裂果的关系。主要研究结果如下：1.‘泰山早霞’果实成熟过程中，内源乙烯大量积累，PG酶活性急剧增加，果实硬度快速下降；乙烯抑制剂1-MCP能够抑制内源乙烯合成，同时PG酶活性下降，果实硬度软化趋势被延缓，果实裂果现象也被抑制。2.在‘泰山早霞’果实整个发育过程中ZMdERF1基因持续性表达；ZMdEIL2基因的表达量在果实发育前期和后期均较高，中期比较低；而且，ZMdERF1和ZMdEIL2基因的表达丰度均在花后65d即内源乙烯开始大量积累时增高；ZMdERF2基因的表达量在花后75d升高；ZMdEIL1和ZMdEIL3基因的表达量在果实的整个发育过程中都较低。ZMdPG1基因的表达量在果实生长发育过程中较低，在软化果实和裂果果实中显著增强。用乙烯抑制剂1-MCP处理果实后，伴随着内源乙烯积累的迅速降低，ZMdPG1、ZMdERF1、ZMdEIL1和ZMdEIL2基因的转录明显被抑制，ZMdERF2的表达也降低，ZMdEIL3基因的表达未有明显的变化。ZMdPG1、ZMdERF1、ZMdERF2和ZMdEIL2基因的表达响应内源乙烯的调控，并协同调节苹果果实的成熟软化和裂果。3.利用RT-PCR技术克隆了ERFs家族的ZMdERF1和ZMdERF2，EIN3/EILs家族的ZMdEIL1、ZMdEIL2、ZMdEIL3和功能基因ZMdPG1；其中，ZMdERF1和ZMdERF2的氨基酸序列包含ERFs家族的两个保守区域YRG和RAYD，ZMdEIL1、ZMdEIL2和ZMdEIL3的氨基酸序列含有EIN3/EILs家族的特征元件AD、BDI、BDII、BDIII、BDIV、BDV和PR，并采用High-tail PCR克隆得到ZMdPG1的启动子，它包含有多个调控元件，如：A-box、AT-rich sequence、BoxI、G-Box、BoxIII、CCGTCC-box、CGTCA-motif等。亚细胞定位显示ZMdEIL1、ZMdEIL2、ZMdEIL3、ZMdERF1和ZMdERF2均定位在细胞核内，ZMdPG1定位在细胞壁和细胞质膜中。4.在拟南芥中超表达ZMdPG1基因，加速了果皮细胞壁的降解，细胞与细胞之间的结合力减弱从而引发果皮缝合处的细胞分离，导致果荚提早开裂，而反义ZMdPG1转基因拟南芥抑制了果荚正常开裂。在番茄中超表达ZMdPG1基因引起大量落花和果实不完全发育。5. ZMdPG1启动子上含有多个调控元件，其中包括蛋白结合元件BOXIII，但由ZMdPG1启动子合成的探针不与ZMdERF1蛋白结合，表明ZMdERF1不直接调控目的基因ZMdPG1。6.苹果乙烯信号编码基因之间存在相互作用，ZMdERF1/ZMdEIL2组合之间和ZMdERF2/ZMdEIL2组合之间分别存在互补关系，表明ZMdERF1蛋白和ZMdERF2蛋白特异的与ZMdEIL2蛋白互作。

全文目录


中英文缩略表  5-7
目录  7-12
中文摘要  12-14
Abstract  14-16
1 前言  16-33
  1.1 乙烯的生理作用  16-19
    1.1.1 乙烯调节种子休眠和萌发  16-17
    1.1.2 乙烯诱导三重反应  17
    1.1.3 乙烯促进衰老与脱落  17-18
    1.1.4 乙烯促进果实成熟与软化  18-19
    1.1.5 乙烯调控胁迫反应  19
  1.2 乙烯生物合成  19-22
    1.2.1 乙烯生物合成途径  19-20
    1.2.2 乙烯生物合成相关酶和编码基因的功能  20-21
      1.2.2.1 ACC 合成酶和编码基因的功能  20
      1.2.2.2 ACC 氧化酶和编码基因的功能  20-21
      1.2.2.3 SAM 合成酶和编码基因的功能  21
      1.2.2.4 SAM 水解酶和编码基因的功能  21
    1.2.3 乙烯生物合成与果实成熟衰老的调控  21-22
  1.3 乙烯信号转导  22-29
    1.3.1 乙烯信号转导线性模型建立  22
    1.3.2 乙烯信号转导元件  22-29
      1.3.2.1 乙烯信号的感知  22-24
        1.3.2.1.1 乙烯受体的功能  22-23
        1.3.2.1.2 乙烯受体与果实成熟  23-24
      1.3.2.2 CTR1  24
        1.3.2.2.1 CTR1 的功能  24
        1.3.2.2.2 CTR1 与果实成熟  24
      1.3.2.3 EIN2  24-25
        1.3.2.3.1 EIN2 的结构和功能  24-25
      1.3.2.4 EIN3/EILs  25-26
        1.3.2.4.1 EIN3/EILs 的结构和功能  25-26
        1.3.2.4.2 EIN3/EILs 与果实成熟  26
      1.3.2.5 ERFs  26-28
        1.3.2.5.1 ERFs 的结构和功能  26-27
        1.3.2.5.2 ERFs 与果实成熟  27-28
      1.3.2.6 EBFs  28-29
        1.3.2.6.1 EBFs 的结构与功能  28
        1.3.2.6.2 EBFs 与果实成熟  28-29
  1.4 细胞壁代谢与果实成熟  29-31
    1.4.1 PG 酶促进果实成熟软化和脱落  29-30
    1.4.2 植物激素对 PG 活性的调节  30
    1.4.3 PG 基因与果实成熟软化  30-31
  1.5 1-MCP 的作用和应用  31
  1.6 研究的目的和意义  31
  1.7 研究的主要内容  31-33
2 材料与方法  33-53
  2.1 试验材料  33-34
    2.1.1 植物材料及生长条件  33
    2.1.2 菌株和质粒  33
    2.1.3 酶及生化试剂  33-34
    2.1.4 PCR 引物  34
  2.2 实验方法  34-53
    2.2.1 乙烯释放的测定  34
      2.2.1.1 果实硬度的测定  34
    2.2.2 多聚半乳糖醛酸酶（PG 酶）活性测定  34
    2.2.3 总 RNA 提取  34-35
    2.2.4 反转录 cDNA 第一链的合成  35
    2.2.5 基因组 DNA 的提取及纯化  35-36
    2.2.6 半定量 RT-PCR 分析  36-37
    2.2.7 PCR 扩增  37
      2.2.7.1 基因扩增  37
      2.2.7.2 基因组序列扩增  37
      2.2.7.3 启动子扩增  37
    2.2.8 PCR 产物的回收  37-38
    2.2.9 连接反应  38
    2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及碱法小量质粒 DNA 的提取  38-40
      2.2.10.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  38-39
      2.2.10.2 大肠杆菌感受态细胞转化  39
      2.2.10.3 质粒 DNA 提取  39-40
    2.2.11 根癌农杆菌感受态细胞的制备与转化  40-41
      2.2.11.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备  40
      2.2.11.2 根癌农杆菌感受态细胞的转化  40-41
    2.2.12 DNA 序列测定  41
    2.2.13 表达载体的构建  41-42
      2.2.13.1 35S:ZMdPG1 表达载体的构建  41
      2.2.13.2 anti-ZMdPG1 表达载体的构建  41-42
      2.2.13.3 ZMdPG1:GUS 表达载体的构建  42
      2.2.13.4 GFP 融合表达载体的构建  42
      2.2.13.5 双分子荧光互补表达载体的构建  42
      2.2.13.6 原核表达载体的构建  42
    2.2.14 农杆菌介导的遗传转化  42-45
      2.2.14.1 拟南芥遗传转化  42-43
      2.2.14.2 番茄遗传转化  43-44
      2.2.14.3 苹果愈伤遗传转化  44
      2.2.14.4 洋葱表皮遗传转化  44-45
    2.2.15 转基因材料的鉴定  45
    2.2.16 亚细胞定位  45-46
    2.2.17 双分子荧光互补  46
    2.2.18 半薄切片  46
    2.2.19 蛋白质技术  46-49
      2.2.19.1 原核表达诱导蛋白  46-47
      2.2.19.2 纯化蛋白  47
      2.2.19.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  47-49
    2.2.20 凝胶阻滞试验（EMSA）  49-53
      2.2.20.1 EMSA 探针生物素标记  49-50
      2.2.20.2 凝胶阻滞电泳  50-53
3 结果与分析  53-78
  3.1 ‘泰山早霞’和‘辽伏’果实乙烯合成、果实硬度和 PG 酶活性变化  53-55
    3.1.1 ‘泰山早霞’和‘辽伏’果实乙烯合成  53
    3.1.2 ‘泰山早霞’和‘辽伏’果实 PG 酶活性变化  53-54
    3.1.3 ‘泰山早霞’果实软化和裂果  54-55
  3.2 ZMdERFs、ZMdEILs 和 ZMdPG1 基因表达量分析  55-56
  3.3 ZMdERFs、ZMdEILs 和 ZMdPG1 基因克隆与序列分析  56-66
    3.3.1 ZMdERFs 基因克隆与序列分析  56-59
      3.3.1.1 ZMdERF1 和 ZMdERF2 基因的克隆  56
      3.3.1.2 ZMdERFs 基因序列分析  56-57
      3.3.1.3 ZMdERFs 蛋白系统进化分析  57-59
    3.3.2 ZMdEILs 基因克隆与序列分析  59-62
      3.3.2.1 ZMdEILs 基因克隆  59
      3.3.2.2 ZMdEILs 基因序列分析  59
      3.3.2.3 ZMdEILs 蛋白系统进化分析  59-62
    3.3.3 ZMdPG1 基因克隆与序列分析  62
      3.3.3.1 ZMdPG1 基因克隆  62
      3.3.3.2 ZMdPG1 基因序列分析  62
      3.3.3.3 ZMdPG1 蛋白系统进化分析  62
    3.3.4 ZMdPG1 基因启动子克隆与序列分析  62-66
  3.4 ZMdERFs、ZMdEILs 和 ZMdPG1 亚细胞定位  66-67
  3.5 转基因功能分析  67-73
    3.5.1 转基因拟南芥 GUS 染色分析  67-68
      3.5.1.1 ZMdQP:GUS 表达载体构建  67-68
      3.5.1.2 转基因拟南芥 GUS 染色分析  68
    3.5.2 35S:ZMdPG1 转基因拟南芥功能分析  68-70
      3.5.2.1 35S:ZMdPG1 转基因表达载体构建  68-70
      3.5.2.2 35S:ZMdPG1 转基因拟南芥表型分析  70
    3.5.3 GUS 染色分析  70-71
    3.5.4 转基因番茄功能分析  71-73
  3.6 凝胶阻滞电泳试验（EMSA）分析  73-76
    3.6.1 ZMdERF1 和 ZMdERF2 原核表达分析及蛋白诱导纯化  73-74
      3.6.1.1 ZMdERF1 和 ZMdERF2 原核表达载体构建  73
      3.6.1.2 ZMdERF1 蛋白诱导和纯化  73-74
      3.6.1.3 ZMdERF2 蛋白诱导和纯化  74
    3.6.2 ZMdERF1 蛋白与 ZMdPG1 启动子的 EMSA 分析  74-76
  3.7 ZMdERFs 和 ZMdEILs 双分子荧光互补分析  76-78
    3.7.1 ZMdERFs 和 ZMdEILs 双分子荧光互补表达载体构建  76-77
    3.7.2 ZMdERFs 和 ZMdEILs 双分子荧光互补分析  77-78
4 讨论  78-84
  4.1 乙烯促进苹果果实软化和裂果  78-79
  4.2 乙烯调控 ZMdERFs、ZMdEILs 和 ZMdPG1 基因  79-81
  4.3 ZMdPG1 基因起始果实软化和裂果  81-82
  4.4 ZMdPG1 导致落花和果实不完全发育  82
  4.5 探讨乙烯信号对果实软化和裂果的调控机理  82-84
5 结论与展望  84-85
  5.1 结论  84
  5.2 推论  84
  5.3 展望  84-85
6 参考文献  85-104
7 附录  104-113
攻读学位期间完成的论文  113-114
致谢  114

相似论文

  1. 二甲醚羰基化制醋酸乙烯中间体二醋酸亚乙酯研究,TQ225.12
  2. 聚乙烯亚胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究,R450
  3. 超高分子量聚乙烯纤维抗蠕变性能研究,TQ342.61
  4. PVA基复合包装材料纳米SiO2改性及其对咸鸭蛋保鲜效果的影响,TS253.46
  5. 水稻Pib启动子中乙烯和茉莉酸响应元件的转基因分析,S511
  6. 磷铵类两性离子修饰的新型抗凝血材料的合成与性质研究,R318.08
  7. 全降解聚乙烯地膜的制备与性能研究,TQ320.721
  8. 聚乙烯塑料食品包装材料中有毒有害物质的测定及迁移研究,TS206.4
  9. 牛血清蛋白和鱼精蛋白从NOCC/海藻酸盐水凝胶中的释放：两种不同等电点的生物分子的对照试验,R943
  10. 无规和间规聚苯乙烯的液液转变,TQ325.2
  11. 聚乙烯醇/聚苯乙烯复合纳米纤维的制备与表征,TQ340.1
  12. 正比计数管及其屏蔽层厚度的Monte Carlo（MCNP）研究,TL811.2
  13. 熔体纺丝法制备超高分子量聚乙烯纤维,TQ342.61
  14. 聚偏氟乙烯的ATRP法改性,TQ325.4
  15. 聚乙烯亚胺接枝氧化石墨烯作为基因传递载体的研究,R450
  16. 采用陶瓷—陶瓷与金属—聚乙烯假体行全髋关节置换术的比较研究,R687.4
  17. 聚乙烯醇/聚氨酯共混纳米纤维膜的制备及荧光改性,TB383
  18. 蜂窝织物/聚氯乙烯复合材料的制备及其隔音性能研究,TB332
  19. Harris-GalanteⅠ与Reflection生物型髋臼假体中期疗效的对比研究,R318.17
  20. 急性应激对大鼠脑中脱落酸变化的影响,Q42
  21. 锦纶导电纤维及其复合材料的制备与性能研究,TQ342.1

中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 苹果
© 2012 www.xueweilunwen.com