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ALA和PHBA缓解黄瓜高温胁迫时以及转fhy3基因拟南芥中基因组DNA甲基化变化

作　者: 张静
导　师: 白吉刚
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄瓜拟南芥 5-氨基乙酰丙酸对羟基苯甲酸高温胁迫抗氧化酶 DNA甲基化
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着温室效应的影响，高温天气的出现愈加频繁。高温是蔬菜栽培过程中常见的逆境因子，严重影响蔬菜的产量。黄瓜也称胡瓜、青瓜，属葫芦科植物，是我国主要栽培蔬菜之一，是一种喜温而不耐高温的蔬菜。因此，黄瓜耐热性研究具有重要的意义。本实验报告了外源5-氨基乙酰丙酸（ALA）和对羟基苯甲酸（PHBA）缓解黄瓜幼苗高温胁迫的机制，研究了外源ALA和PHBA对高温胁迫下黄瓜幼苗生长量、抗氧化酶的活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量和DNA甲基化的影响，分离了高温胁迫下外源ALA和PHBA诱导的甲基化差异片段，然后对这些差异片段进行克隆、测序和序列的生物信息学分析。本实验从抗氧化酶和整个基因组水平上初步揭示ALA和PHBA缓解高温胁迫的机制，为利用甲基化差异基因打下基础，并为其它外源物质缓解植物逆境胁迫的机制研究提供参考。转基因食品安全性是人们讨论的焦点。在转基因植物中，内部和外部的环境因素会对未转化的外源基因的甲基化程度产生影响，从而影响基因的表型。外源基因的转入会导致与外源基因同源的内源基因沉默，并且转入外源基因会为宿主植物基因组带来不可预期的影响。本实验通过对转fhy3基因拟南芥DNA甲基化的研究，分离了野生型、突变体和转fhy3基因拟南芥的甲基化差异片段，然后对这些差异片段进行克隆、测序和序列的生物信息学分析，并对与拟南芥基因组相似性高的三个基因进行实时荧光定量分析，并通过亚硫酸盐测序来验证MSAP结果。我们的目的是研究转入外源基因是否会影响转基因植物基因组中与其不同源基因的DNA甲基化的变化。我们的研究也为了解转入外源基因对转基因植物带来的影响打下基础。待黄瓜幼苗长至两叶一心时，分别用3μMALA和0.5mM PHBA于常温（25/18°C）条件下处理黄瓜幼苗2d，然后转入高温（42/38°C）环境中处理。高温胁迫结束后取第二片真叶，测定其抗氧化酶活性和抗氧化物的含量。同时，实验还提取了黄瓜叶片的基因组DNA，并利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术研究黄瓜叶片基因组DNA甲基化的水平和状态变化，分别对高温胁迫下ALA和PHBA预处理诱导的DNA甲基化差异片段进行回收、克隆和测序分析，并通过实时荧光定量测定了差异基因在黄瓜不同组织的表达水平，利用亚硫酸盐测序来验证MSAP的准确性。拟南芥野生型、fhy3突变体和GUS-FHY3（转fhy3基因拟南芥）的种子在22℃条件下萌发和成长，收集拟南芥的根、节间、花和莲座叶保存于液氮中，用于提取拟南芥的基因组DNA和总RNA，利用MSAP技术研究拟南芥基因组DNA甲基化的水平和状态变化，对差异片段进行回收、克隆和测序分析，并通过实时荧光定量测定了差异基因在拟南芥不同组织的表达水平，利用亚硫酸盐测序来验证MSAP的准确性。主要结果如下：（1）高温胁迫下外源ALA和PHBA对黄瓜幼苗生长的影响高温胁迫使黄瓜幼苗生长指标均显著下降，叶片萎蔫；而经过ALA或PHBA预处理再进行高温胁迫的黄瓜幼苗，生长指标明显升高，叶片萎蔫率下降。高温胁迫严重抑制了黄瓜幼苗的生长，ALA和PHBA处理均缓解了高温胁迫对黄瓜生长的抑制作用。（2）高温胁迫下外源ALA和PHBA对黄瓜叶片抗氧化酶及相关指标的影响在外源ALA或PHBA预处理实验中，高温胁迫使幼苗叶片的MDA和ROS含量高于对照组。与高温胁迫相比，利用外源ALA或PHBA预处理后再进行高温胁迫时增强了黄瓜叶片抗氧化酶SOD、CAT、GPX、GSHPx、APX、MDHAR、DHAR和GR的活性，因而降低了叶片的MDA含量和ROS含量。由此可知，外源ALA和PHBA预处理都提高了黄瓜叶片抗氧化酶的活性，减少了活性氧含量，进而减轻了高温胁迫对黄瓜幼苗的伤害。（3）高温胁迫下外源ALA和PHBA对黄瓜叶片DNA甲基化的影响本实验对黄瓜叶片基因组DNA进行了MSAP分析，两个实验中甲基化敏感扩增位点多态位点占总扩增位点数的比例均在19%-21%之间。高温和ALA或PHBA预处理均导致了黄瓜基因组DNA甲基化状态发生改变。通过克隆所得的差异片段均与黄瓜基因组具有高度相似性，并利用实时荧光定量技术测定差异基因在黄瓜不同组织的表达水平和亚硫酸盐测序的方法验证差异片段。（4）转fhy3基因拟南芥或fhy3突变体对拟南芥叶片DNA甲基化的影响本实验对拟南芥叶片基因组DNA进行了MSAP分析，实验中甲基化敏感扩增位点多态位点占总扩增位点数的比例均在10%-12%之间。fhy3突变体和转fhy3基因均导致了拟南芥基因组DNA甲基化状态发生改变，通过克隆所得的差异片段均与拟南芥基因组具有高度相似性，并利用实时荧光定量技术测定差异基因在拟南芥不同组织的表达水平和亚硫酸盐测序的方法验证差异片段。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-13
1 引言  13-19
  1.1 研究高温胁迫的意义  13
  1.2 高温胁迫对植物的影响  13-15
  1.3 转基因植物的安全性  15
  1.4 高温胁迫和外源基因对植物基因组DNA甲基化的影响  15-17
  1.5 外源ALA和PHBA预处理缓解逆境胁迫及fhy3 基因的研究进展  17
  1.6 本研究的目的意义  17-19
2 材料与方法  19-32
  2.1 材料  19-20
  2.2 方法  20-32
    2.2.1 外源 5-氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对高温胁迫的缓解作用  20-25
      2.2.1.1 5-氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸处理浓度的确定  20
      2.2.1.2 植株生长量的测定  20
      2.2.1.3 丙二醛（MDA）活性的测定  20
      2.2.1.4 过氧化氢（H2O2）含量测定  20
      2.2.1.5 O2.-含量测定  20-21
      2.2.1.6 抗氧化酶活性的测定  21-22
      2.2.1.7 蛋白质含量的测定  22
      2.2.1.8 脯氨酸和可溶性糖含量的测定  22
      2.2.1.9 谷胱甘肽含量的测定  22-23
      2.2.1.10 叶片抗氧化酶活性及相关指标的统计分析  23
      2.2.1.11 Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和GPX基因表达量的测定  23-25
    2.2.2 外源 5-氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对黄瓜植株DNA甲基化的影响  25-32
      2.2.2.1 基因组DNA的提取与纯化  25-26
      2.2.2.2 甲基化敏感扩增多态性分析  26-32
3 结果与分析  32-70
  3.1 5-氨基乙酰丙酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜的影响  32-45
    3.1.1 5-氨基乙酰丙酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜幼苗的形态学影响  32
    3.1.2 5-氨基乙酰丙酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜MDA和ROS含量的影响  32
    3.1.3 5-氨基乙酰丙酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜抗氧化酶活性的影响  32
    3.1.4 5-氨基乙酰丙酸预处理缓解高温胁迫时对脯氨酸和可溶性糖含量的影响  32-34
    3.1.5 5-氨基乙酰丙酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜DNA甲基化的影响  34-39
      3.1.5.1 基因组DNA的提取与纯化、酶切、连接和选择性扩增  34-36
      3.1.5.2 5-氨基乙酰丙酸预处理对高温胁迫下黄瓜DNA甲基化状态及水平的影响  36-39
    3.1.6 差异片段的测序及序列分析结果  39
    3.1.7 基因Csa018496 和Csa025705 的亚硫酸盐测序结果分析  39-40
    3.1.8 甲基化差异基因在黄瓜幼苗不同组织中的表达水平  40-45
  3.2 对羟基苯甲酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜的影响  45-62
    3.2.1 不同浓度的对羟基苯甲酸预处理对高温胁迫下黄瓜幼苗的形态学影响  45-48
    3.2.2 对羟基苯甲酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜幼苗的形态学影响  48-49
    3.2.3 对羟基苯甲酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜MDA和ROS含量的影响  49-50
    3.2.4 对羟基苯甲酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜抗氧化酶活性的影响  50-52
    3.2.5 对羟基苯甲酸和高温胁迫对Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和GPX表达量的影响  52
    3.2.6 对羟基苯甲酸预处理和高温胁迫时对黄瓜GSH含量和GSH/GSSG的影响  52-53
    3.2.7 对羟基苯甲酸预处理缓解高温胁迫时对黄瓜DNA甲基化的影响  53-57
      3.2.7.1 基因组DNA的提取与纯化、酶切、连接和选择性扩增  53-54
      3.2.7.2 对羟基苯甲酸预处理对高温胁迫下黄瓜DNA甲基化状态及水平的影响  54-57
    3.2.8 差异片段的测序及序列分析结果  57
    3.2.9 基因Csa010600 和Csa013767 的亚硫酸盐测序结果分析  57-58
    3.2.10 基因Csa010600、Csa013767 和Csa000831 在黄瓜幼苗不同组织中的表达  58-62
  3.3 fhy3 基因对转fhy3 基因拟南芥DNA甲基化状态的影响  62-70
    3.3.1 基因组DNA的提取与纯化、酶切、连接和选择性扩增  62-63
    3.3.2 转fhy3 基因对拟南芥DNA甲基化状态及水平的影响  63-65
    3.3.3 差异片段的测序及序列分析结果  65-66
    3.3.4 基因AT4G16835、AT4G33625 和AT1G41797 的亚硫酸盐测序结果  66-70
4 讨论  70-79
  4.1 ALA或PHBA对黄瓜幼苗高温胁迫的缓解作用  70-73
  4.2 ALA或PHBA预处理对高温胁迫下黄瓜叶片DNA甲基化的影响  73-76
  4.3 fhy3 基因对转fhy3 基因拟南芥DNA甲基化的影响  76-79
5 结论  79-80
参考文献  80-92
致谢  92-93
攻读学位期间发表论文情况  93

ALA和PHBA缓解黄瓜高温胁迫时以及转fhy3基因拟南芥中基因组DNA甲基化变化

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