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5-氨基乙酰丙酸和阿魏酸缓解干旱胁迫以及茉莉酸甲酯缓解低温胁迫时黄瓜基因组DNA甲基化变化

作　者: 李冬美
导　师: 白吉刚
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄瓜 5-氨基乙酰丙酸阿魏酸茉莉酸甲酯干旱胁迫低温胁迫抗氧化酶非酶抗氧化物 DNA甲基化亚硫酸氢盐测序
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

干旱和低温是蔬菜栽培过程中常见的逆境因子，由于现在世界上很多地方都存在干旱现象，很多蔬菜栽培基地都受到低温影响，因此探明干旱与低温胁迫对植物生长的影响以及缓解胁迫的方法对植物的栽培和生长具有重要意义。本实验报告了外源5-氨基乙酰丙酸（ALA）和阿魏酸（FA）缓解黄瓜幼苗干旱胁迫以及茉莉酸甲酯（MeJA）缓解黄瓜幼苗低温胁迫的机制，分别研究了这三种外源药物在干旱或低温胁迫下对黄瓜幼苗的生长指标、叶片超微结构、抗氧化酶以及基因组DNA甲基化的影响，并分离了干旱或低温胁迫下外源ALA、FA或MeJA诱导的DNA甲基化差异片段，并进一步对这些差异片段进行克隆、测序和序列分析。本文从宏观、微观、生理和分子水平上揭示外源ALA和FA缓解黄瓜干旱胁迫以及外源MeJA缓解黄瓜低温胁迫的机制，为外源ALA、FA或MeJA在黄瓜抗旱或抗低温生产中的应用提供依据，并为研究其它外源物质缓解植物逆境胁迫的机制提供参考。具体研究结果如下：（1）外源ALA和FA缓解干旱胁迫以及外源MeJA缓解低温胁迫时对黄瓜幼苗生长指标、抗氧化酶及相关指标的影响实验中，干旱胁迫和低温胁迫分别导致“粤秀三号”和“津春四号”黄瓜幼苗生长指标显著下降；外源ALA、FA或MeJA处理后再进行干旱或低温胁迫的黄瓜幼苗中，各生长指标明显上升。所以，干旱胁迫和低温胁迫严重抑制了黄瓜幼苗的生长，而外源ALA、FA或MeJA处理缓解了干旱和低温胁迫对黄瓜幼苗生长的抑制作用。在本实验中，干旱和低温胁迫分别使黄瓜幼苗叶片（第二片真叶）的MDA和（或）内源H₂O₂含量以及O₂^.-的产生速率高于对照。但用外源ALA、FA或MeJA预处理黄瓜幼苗后再进行干旱或低温胁迫时，黄瓜叶片中SOD、CAT、GPX、GSH-Px、APX、DHAR、MDHAR和GR等抗氧化物酶的活性、抗氧化物AsA和GSH的含量以及脯氨酸和可溶性糖的含量都明显升高，从而降低了叶片的MDA含量、内源H₂O₂含量以及O₂^.-的产生速率。由此我们推断，外源ALA、FA或MeJA预处理提高了黄瓜叶片抗氧化酶的活性，减少了活性氧含量，进而减轻了干旱或低温胁迫对叶片膜系统的伤害。（2）外源ALA、FA或MeJA预处理对干旱或低温胁迫下黄瓜基因组DNA甲基化的影响通过MSAP分析，我们发现干旱和低温胁迫都对黄瓜叶片基因组甲基化水平影响不大，而外源ALA、FA或MeJA预处理却能提高黄瓜叶片基因组去甲基化的几率。干旱和低温胁迫后黄瓜基因组DNA的总甲基化比率得到提高，而外源ALA、FA或MeJA预处理后总甲基化比率却有所下降。通过对DNA甲基化差异片段进行序列分析，我们发现干旱和低温胁迫和外源ALA、FA或MeJA预处理诱导的DNA甲基化主要分布在基因组编码区，且与黄瓜基因组具有高度的相似性。我们进一步研究了甲基化差异基因在第二片真叶、第一片真叶、根、茎和子叶中的表达量，发现甲基化差异基因具有组织表达特异性。亚硫酸氢盐测序分析结果显示，为缓解干旱和低温胁迫，ALA、FA或MeJA预处理使得甲基化差异基因内CpG位点的甲基化水平发生了一定的变化。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-11
1 前言  11-19
  1.1 研究干旱和低温胁迫的意义  11
  1.2 干旱和低温胁迫对植物形态结构的影响  11-12
  1.3 干旱和低温胁迫对植物体内抗氧化酶的影响  12-13
    1.3.1 活性氧的产生与危害  12-13
    1.3.2 植物体内的抗氧化系统  13
    1.3.3 干旱和低温胁迫对抗氧化酶的影响  13
  1.4 干旱和低温胁迫对植物基因组 DNA 甲基化的影响  13-17
    1.4.1 植物 DNA 甲基化的建立和维持机制  14-15
    1.4.2 植物 DNA 甲基化的生物学功能  15-16
    1.4.3 DNA 甲基化的检测方法  16
    1.4.4 干旱和低温胁迫对 DNA 甲基化的影响  16-17
  1.5 外源 ALA、FA 和 MeJA 预处理缓解逆境胁迫的研究进展  17
  1.6 本研究的目的意义  17-19
2 材料与方法  19-31
  2.1 材料  19
  2.2 方法  19-31
    2.2.1 外源 ALA 和 FA 对黄瓜干旱胁迫、MeJA 对低温胁迫的缓解作用  20-23
      2.2.1.1 黄瓜生长量的测定  20
      2.2.1.2 叶片超微结构的透射电子显微镜观测  20-21
      2.2.1.3 黄瓜抗氧化酶活性及相关指标的测定  21-23
    2.2.2 干旱或低温胁迫下外源 ALA、FA 或 MeJA 对黄瓜 DNA 甲基化的影响  23-31
      2.2.2.1 黄瓜基因组 DNA 的提取与纯化  23-24
      2.2.2.2 甲基化敏感扩增多态性分析  24-31
3 结果与分析  31-63
  3.1 外源 ALA 和 FA 对黄瓜干旱胁迫、MeJA 对低温胁迫的缓解作用  31-43
    3.1.1 干旱或低温胁迫下 ALA、FA 或 MeJA 对黄瓜第二片真叶形态结构的影响  31-32
    3.1.2 干旱或低温胁迫下 ALA、FA 或 MeJA 对黄瓜生长指标和超微结构的影响  32-36
    3.1.3 外源 ALA、FA 或 MeJA 对干旱或低温胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶活性的影响  36-43
      3.1.3.1 外源 ALA、FA 或 MeJA 对干旱或低温胁迫下 ROS 和 MDA 含量的影响  36-37
      3.1.3.2 外源 ALA、FA 或 MeJA 对干旱或低温胁迫下抗氧化酶活性的影响  37-41
      3.1.3.3 外源 FA 对干旱胁迫下 Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT 和 GPX 表达量的影响  41
      3.1.3.4 外源 ALA 对干旱胁迫下黄瓜叶片非酶抗氧化物水平的影响  41-42
      3.1.3.5 外源 FA 对干旱胁迫下黄瓜叶片脯氨酸和可溶性糖含量的影响  42-43
  3.2 外源 ALA、FA 或 MeJA 对干旱或低温胁迫下黄瓜 DNA 甲基化的影响  43-63
    3.2.1 基因组 DNA 的提取和纯化、酶切和 PCR 扩增  43-44
    3.2.2 干旱和低温胁迫下外源 ALA、FA 或 MeJA 对黄瓜叶片 DNA 甲基化的影响  44-52
    3.2.3 差异片段的测序及序列分析结果  52-54
    3.2.4 部分差异基因的表达水平分析  54-61
    3.2.5 亚硫酸盐测序分析  61-63
4 讨论  63-70
  4.1 外源 ALA、FA 或 MeJA 对黄瓜干旱或低温胁迫的缓解作用  63-66
    4.1.1 干旱和低温胁迫下 ALA、FA 或 MeJA 对黄瓜生长指标和超微结构的影响  63
    4.1.2 外源 ALA、FA 或 MeJA 对干旱或低温胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶的影响  63-66
  4.2 外源 ALA、FA 或 MeJA 对干旱或低温胁迫下黄瓜叶片 DNA 甲基化的影响  66-70
5 结论  70-71
参考文献  71-82
致谢  82-83
攻读学位期间发表论文情况  83

5-氨基乙酰丙酸和阿魏酸缓解干旱胁迫以及茉莉酸甲酯缓解低温胁迫时黄瓜基因组DNA甲基化变化

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