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苜蓿再生体系的建立与转化体系的条件探索

作　者: 许来俊
导　师: 王成章
学　校: 河南农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 紫花苜蓿再生体系根癌农杆菌遗传转化
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

苜蓿(Medicago saliva L.)为世界上分布最广的一种牧草,享有“牧草之王”的美誉。因其秋眠性与生产性能和抗寒性相关,现成为各地选择适宜品种的首要指标,但是目前苜蓿秋眠的机理却不清楚,急需我们在苜蓿秋眠的研究上有所突破。本研究首先建立苜蓿植株的再生体系,后通过对农杆菌介导的?蓿遗传转化体系建立的条件进行探索来试图获得phyA和phyB的RNA干扰植株,以研究phyA和phyB的基因功能及苜蓿秋眠的分子调控机理。主要研究结果如下：1、再生体系的建立。对于不同的品种和不同的外植体来说,其愈伤诱导能力各不相同。品种伏纳尔和WL-525HQ,无论是子叶还是下胚轴,其诱导率均高于WL-343HQ和WL-232HQ;对于外植体来说,下胚轴的愈伤诱导率要极显著高于子叶。2,4-D的合适浓度为2mg/L,高浓度的2,4-D容易引起褐化;对于不同的细胞分裂素来说,在2,4-D浓度为2mg/L的情况下,KT和6-BA都是随着浓度的升高,其外植体的愈伤诱导率在不断的降低。故选择出愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+2mg/L2,4-D+0.25mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉：适宜的分化培养基为MS+0.5mg/L KT+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉,分化出苗情况最好。故综合考虑秋眠级及再生情况将伏纳尔品种的下胚轴作为最佳的转化受体。2、转化体系条件的探索得到以下结果：农杆菌菌液中目的片段phyA和phyB没有丢失,可放心进行农杆菌介导的遗传转化；最佳的农杆菌侵染时间为10min；合适的羧苄青霉素抑菌浓度为300mg/L;适合的卡那霉素选压为为50mg/L。故建立的转化体系如下：预培养基为MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉;共培养基同预培养基；选择培养基为MS+2mg/L2,4-D+0.25mg/L KT+300mg/L carb+50mg/L kan+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；分化培养基为MS+0.5mg/L KT+0.01mg/L NAA+300mg/L carb+50mg/L kan+30g/L(?)蔗糖+8g/L琼脂粉。

全文目录

致谢  4-5
目录  5-8
摘要  8-9
主要英文縮略词表  9-10
1 文献综述  10-24
  1.1 苜蓿再生体系的研究进展  10-17
    1.1.1 苜蓿的植株再生途径  10-11
      1.1.1.1 直接分化芽再生途径  10
      1.1.1.2 愈伤组织再生途径  10-11
      1.1.1.3 原生质体再生途径  11
      1.1.1.4 胚状体途径  11
    1.1.2 苜蓿再生体系的研究  11-16
      1.1.2.1 品种基因型的选择  11-12
      1.1.2.2 外植体的选择  12-13
      1.1.2.3 基本培养基的选择  13-14
      1.1.2.4 植物生长调节物质  14-15
      1.1.2.5 其他添加物的应用  15-16
    1.1.3 其他方面的研究  16
    1.1.4 苜蓿再生过程中存在的问题及发展前景  16-17
  1.2 苜蓿的秋眠性  17-19
    1.2.1 苜蓿秋眠性的概念  17
    1.2.2 苜蓿秋眠性与抗寒性和产量的关系  17-18
    1.2.3 苜楷秋眠性与光敏色素的关系  18
    1.2.4 苜蓿秋眠的实践意义  18-19
      1.2.4.1 秋眠性在国外实践中的应用  18
      1.2.4.2 秋眠性在国内实践中的应用  18-19
  1.3 转基因苜蓿研究进展  19-24
    1.3.1 常用的基因转化法  19-21
      1.3.1.1 农杆菌转化法  19-20
      1.3.1.2 基因枪转化法  20
      1.3.1.3 电激法  20-21
    1.3.2 转基因苜蓿研究进展  21-22
      1.3.2.1 抗逆性  21
      1.3.2.2 耐盐碱性  21
      1.3.2.3 抗病虫害  21-22
      1.3.2.4 抗除草剂  22
      1.3.2.5 改良苜蓿品质基因  22
    1.3.3 转基因苜蓿存在的问题  22-24
2 引言  24-25
3 试验一紫花苜蓿再生体系的建立  25-36
  3.1 材料与方法  25-28
    3.1.1 试验材料  25-26
      3.1.1.1 植物材料  25
      3.1.1.2 植物激素  25
      3.1.1.3 基本培养基  25-26
      3.1.1.4 设备与器材  26
    3.1.2 试验方法  26-28
      3.1.2.1 无菌苗的获得  26
      3.1.2.2 紫花苜蓿愈伤组织的诱导  26-27
      3.1.2.3 紫花苜蓿愈伤组织的分化  27
      3.1.2.4 生根培养  27
      3.1.2.5 再生苗的移载  27
      3.1.2.6 数据分析与处理  27-28
  3.2 结果与分析  28-32
    3.2.1 愈伤组织的诱导  28-31
      3.2.1.1 不同外植体愈伤组织的诱导  28-29
      3.2.1.2 不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响  29-30
      3.2.1.3 不同细胞分裂素浓度对愈伤组织诱导的影响  30-31
    3.2.2 愈伤组织的分化培养  31-32
  3.3 结论与讨论  32-36
    3.3.1 小结  32
    3.3.2 讨论  32-36
      3.3.2.1 不同外植体和不同基因型的选择  32
      3.3.2.2 生长调节物质对愈伤组织的诱导及分化的影响  32-33
      3.3.2.3 褐化原因  33
      3.3.2.4 试验过程中的问题总结  33-36
4 试验二、紫花苜蓿转化体系的条件探索  36-45
  4.1 材料与方法  36-39
    4.1.1 材料  36-37
      4.1.1.1 植物材料  36
      4.1.1.2 农杆菌菌株和质粒  36
      4.1.1.3 农杆菌培养基  36-37
      4.1.1.4 主要试剂  37
      4.1.1.5 主要仪器  37
    4.1.2 试验方法  37-39
      4.1.2.1 表达载体的签定  37-38
      4.1.2.2 农杆菌菌液的制备  38
      4.1.2.3 最佳浸染时间的确定  38
      4.1.2.4 抗菌素浓度的确定  38-39
      4.1.2.5 选择培养基中卡那霉素选择压的确定  39
  4.2 结果与分析  39-42
    4.2.1 目的片段的鉴定  39-40
    4.2.2 最佳浸染时间的确定  40
    4.2.3 愈伤诱导中抗菌素浓度的确定  40-41
    4.2.4 卡那霉素合适选择压的确定  41-42
  4.3 结论与讨论  42-45
    4.3.1 结论  42-43
    4.3.2 讨论  43-45
      4.3.2.1 抗生素浓度的选择  43
      4.3.2.2 卡那选择压大小的确定  43-44
      4.3.2.3 转化的流程  44
      4.3.2.4 获得转基因植株的条件  44-45
5 结论与展望  45-46
  5.1 结论  45
  5.2 展望  45-46
参考文献  46-55
英文摘要  55-56

苜蓿再生体系的建立与转化体系的条件探索

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