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玉米对生叶序相关候选基因Zmphy的克隆及转化研究

作　者: 魏巍
导　师: 程备久
学　校: 安徽农业大学
专　业: 作物生物技术
关键词: 玉米对生叶序侯选基因遗传转化
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 9次
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内容摘要

玉米对生叶序突变体是发育生物学研究的好材料，发掘和克隆其相关基因对揭示玉米叶序发育和转换的分子机制，创新和丰富植物叶序发育的理论，培育对生玉米新品种具有重要的理论意义和应用价值。本研究利用前期分析筛选的对生叶序调控相关的候选基因Zmphy，通过对该基因的克隆和分析、玉米过量表达与RNA干涉转化及对转化株细胞分裂素和生长素含量进行测定，同时对水稻同源基因Osphy进行了研究，获得如下主要结果：1、利用RT-PCR方法克隆了Zmphy，该基因序列全长1043bp，ORF框长为492bp，共编码163个氨基酸。2、应用生物信息学方法对该基因及其编码氨基酸进行分析，结果显示：玉米Zmphy蛋白的理论分子量为18.19kD、理论等电点为9.08，理论上为碱性蛋白质；该蛋白理论上是个亲水性蛋白，不具备跨膜结构；同时预测了该蛋白的二级、三级结构。3、运用RT-PCR方法，对Zmphy进行不同组织表达水平分析，该基因在各组织中的表达量从大到小依次为茎尖、根、茎、雄穗、雌穗、叶，其中茎尖表达最为强烈，叶的表达量最低。4、通过基因枪转化法将P1301-Zmphy-mGFP亚细胞定位表达载体轰击洋葱表皮细胞，初步证实Zmphy蛋白被定位于细胞核中，Zmphy是个核基因。5、构建了过量表达载体和干涉表达载体，并分别利用原位转化法和农杆菌介导法获得转化植株，经分子检测共筛选出阳性转基因植株：T1代Zmphy干涉转基因玉米4株；T0代Osphy过量转基因水稻2株、Osphy干涉转基因水稻4株、Zmphy过量转基因水稻植株3株。6、将T1代Zmphy干涉转基因玉米植株与野生植株的细胞分裂素和生长素含量进行比较，ELISA结果显示：转基因植株相比野生对照植株细胞分裂素含量降低，最高降低23.85%；生长素含量升高,最高上升49.88%。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-8
1 文献综述  8-18
  1.1 植物叶序研究进展  8-13
    1.1.1 叶序概述  8-9
    1.1.2 关于叶序的几何学问题  9-10
    1.1.3 叶序调控理论模型  10-11
    1.1.4 叶序排布机制实验研究  11-13
  1.2 对生玉米研究意义及进展  13-15
    1.2.1 对生玉米主要形态特征  13
    1.2.2 对生玉米的遗传学研究  13-14
    1.2.3 对生玉米的生理生化指标  14
    1.2.4 对生玉米的分子机制研究进展  14-15
  1.3 基因过量表技术和 RNA 干涉技术应用  15-16
  1.4 与侧生器官发生有关联的植物激素  16-18
    1.4.1 生长素对叶发育的影响  16
    1.4.2 细胞分裂素调控茎顶端分生组织发育  16-18
2 引言  18-20
  2.1 技术路线  19-20
3 材料与方法  20-34
  3.1 仪器设备  20
  3.2 实验材料  20-22
    3.2.1 菌株和载体  20
    3.2.2 酶及试剂  20
    3.2.3 培养基配方  20-21
    3.2.4 实验所用溶液  21
    3.2.5 引物合成和测序  21-22
  3.3 基因 Zmphy 来源  22
  3.4 玉米叶序候选基因 Zmphy 的克隆  22-26
    3.4.1 提取玉米茎尖组织总 RNA  22-23
    3.4.2 玉米茎尖组织总 RNA 的检测  23
    3.4.3 构建各载体所需片段的 PCR 扩增  23-24
    3.4.4 大肠杆菌感受态的制备  24-25
    3.4.5 质粒 DNA 小量提取方法  25
    3.4.6 酶切验证阳性质粒克隆方法  25-26
  3.5 基因组织表达分析  26
  3.6 Zmphy 的亚细胞定位分析  26-28
    3.6.1 亚细胞定位载体的构建  26-28
    3.6.2 洋葱（Allium cepa）表皮的基因枪转化  28
  3.7 Zmphy、Osphy 过量表达载体和干涉载体的构建及转化  28-31
    3.7.1 过量表达载体和干涉载体的构建  28-30
    3.7.2 过量表达载体和干涉载体的农杆菌转化  30-31
  3.8 阳性转基因植株的检测  31-32
  3.9 细胞分裂素与生长素的含量测定  32-34
4 结果与分析  34-50
  4.1 玉米叶序调控相关候选基因的获得  34-35
    4.1.1 Zmphy 的基因来源  34-35
    4.1.2 Zmphy 的克隆  35
  4.2 Zmphy 的生物信息学分析  35-41
    4.2.1 Zmphy 系统进化树构建与分析  35-36
    4.2.2 Zmphy 编码的氨基酸序列属性分析  36-37
    4.2.3 Zmphy 蛋白的二级结构分析  37-38
    4.2.4 Zmphy 蛋白疏水性和亲水性分析  38
    4.2.5 Zmphy 蛋白跨膜结构分析  38-39
    4.2.6 Zmphy 蛋白三级结构预测建模  39-41
  4.3 Zmphy 组织表达分析  41
  4.4 Zmphy 亚细胞定位分析  41-43
    4.4.1 亚细胞定位载体的构建  41-42
    4.4.2 Zmphy 核定位信号分析  42-43
  4.5 Zmphy、Osphy 过量表达载体和干涉载体的构建  43-44
    4.5.1 Zmphy 和 Osphy 过量表达载体的构建  43-44
  4.6 Zmphy、Osphy 过表达载体和干涉载体的农杆菌转化  44-46
  4.7 转基因植株的分子检测  46-48
    4.7.1 玉米干涉转基因植株的获得和检测  46
    4.7.2 水稻过量和干涉转基因植株的获得和检测  46-48
  4.8 玉米干涉转基因植株中细胞分裂素、生长素含量测定  48-50
5 讨论  50-54
6 结论  54-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
作者简介及攻读期成果  61

玉米对生叶序相关候选基因Zmphy的克隆及转化研究

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