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利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用

作　者: 熊静
导　师: 余子全
学　校: 湖南师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 蛋白质组学技术苏云金芽胞杆菌 Cry6Aa2 根结线虫秀丽小杆线虫
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性菌,能产生多种杀虫毒素,其在芽胞形成期产生的晶体蛋白对昆虫的毒力作用被广泛研究,已经被用作防治害虫的生物防治制剂。Cry6Aa2晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌产生的一种对线虫具有多种毒力作用的伴胞晶体蛋白,已经有研究报道Cry6Aa2对根结线虫和秀丽小杆线虫都有强毒力作用,其对根结线虫具有强致死作用,对秀丽小杆线虫除了有致死活性外,还能显著抑制其产卵、生长,并导致其运动能力降低。同时当秀丽小杆线虫受到Cry6Aa2攻击时会采取减少摄食、逃逸等方式来逃避毒素的攻击,从而达到保护自己的目的。但是,Cry6Aa2对根结线虫的毒力作用主要包括哪些方面及线虫对Cry6Aa2的防御机制并不清楚。本论文就是针对以上问题检测Cry6Aa2对根结线虫的毒力作用及利用蛋白质组学技术初步研究Cry6Aa2对线虫的作用机制和线虫对Cry6Aa2的防御机制。本文首先用Cry6Aa2对南方根结线虫(Meloidodynidae incognita)进行了致死、孵化、运动及感染等实验,证明Cry6Aa2对南方根结线虫有致死、抑制孵化、抑制线虫运动等多种活性,能阻断根结线虫生活史的多个环节达到防治线虫的效果,存在开发成生物杀线虫剂的潜力。其次,本文利用蛋白质组学技术对Cry6Aa2在对秀丽小杆线虫的作用机制及秀丽小杆线虫防御毒素蛋白中的机制进行了初步的探讨。利用蛋白质组学技术,鉴定出了喂食Cry6Aa2毒素菌的秀丽小杆线虫蛋白质组与对照蛋白质组的10种差异表达蛋白,然后运用qRT-PCR技术鉴定了10种差异蛋白及3种相关蛋白在转录水平上的变化与蛋白表达的相关性,同时还利用突变体秀丽小杆线虫验证了其中3种差异蛋白在Cry6Aa2作用秀丽小杆线虫中所起到的作用。最后的结果显示线虫在防御Cry6Aa2毒素的过程中,产生了热休克应激蛋白,包括HSP-12.2、HSP-6、HSP-25;DIM-1在线虫防御Cry6Aa2中也能起着重要作用；并且,一些与能量相关的途径,如柠檬酸循环,电子传递等途径在线虫防御Cry6Aa2的过程中也出现相应的变化为线虫提供足够的能量。同时,结果显示Cry6Aa2能够刺激DAF-2的上调,抑制DAF-16,因此可能缩短线虫的寿命。本论文首先初步对确定了Cry6Aa2对根结线虫的多种毒力作用,证明Cry6Aa2对根结线虫具有很好的防治效果,但是还需要将Cry6Aa2用于盆栽实验和田间实验,去验证其在盆栽实验和田间实验的效果。其次,该论文初步探索了Cry6Aa2与线虫之间的相互作用,在以后的研究中我们需要对以下几个方面进行深入的探讨：(1)与能量相关的酶及其所在的途径在线虫防御Cry6Aa2毒素时的具体作用过程；(2)DIM-1如何发挥防御Cry6Aa2毒素的作用；(3)Cry6Aa2如何影响线虫寿命。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章绪论  12-22
  1 根结线虫的防治进展  12-14
    1.1 根结线虫的危害  12
    1.2 根结线虫的防治  12-14
  2 苏云金芽胞杆菌杀线虫机制的研究  14-19
    2.1 苏云金芽胞杆菌的生物学特征、分布及产生的活性物质  14-15
    2.2 苏云金芽胞杆菌杀线虫的研究进展  15-19
  3 秀丽小杆线虫简介  19
  4 蛋白质组学的应用与发展  19-20
  5 立题目的和意义  20-22
第二章材料与方法  22-42
  1 材料  22-31
    1.1 供试菌株  22
    1.2 培养基  22-23
    1.3 抗生素浓度  23
    1.4 PCR引物合成  23-24
    1.5 主要试剂盒和试剂  24-25
      1.5.1 主要试剂盒  24
      1.5.2 主要试剂  24-25
    1.6 主要仪器  25-26
    1.7 相关溶液的配制  26-31
      1.7.1 Cry6Aa2对根结线虫的孵化率、半致死率、运动和感染实验的试剂配制  26-28
      1.7.2 双向电泳实验及质谱相关溶液  28-30
      1.7.3 秀丽小杆线虫RNA提取及荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂的配制  30
      1.7.4 Cry6Aa2对秀丽小杆线虫突变体LC_(50)测定试剂的配制  30-31
  2 实验路线  31
  3 实验方法  31-42
    3.1 Cry6Aa2对根结线虫的孵化率、半致死率、运动和感染实验  31-33
      3.1.1 Cry6Aa2晶体蛋白的纯化  31-32
      3.1.2 蛋白含量的测定  32
      3.1.3 Cry6Aa2对根结线虫孵化率影响的实验  32
      3.1.4 根结线虫二龄幼虫的获得  32-33
      3.1.5 Cry6Aa2对根结线虫半致死率实验  33
      3.1.6 Cry6Aa2对根结线虫运动恢复能力的影响  33
      3.1.7 Cry6Aa2对根结线虫感染实验的影响  33
    3.2 双向电泳秀丽小杆线虫蛋白样品的制备  33-35
      3.2.1 Cry6Aa2的IPTG诱导表达  33-34
      3.2.2 秀丽小杆线虫四龄幼虫的获得  34
      3.2.3 秀丽小杆线虫蛋白的提取及样品蛋白的SDS-PAGE检测  34-35
    3.3 双向电泳  35-39
      3.3.1 等点聚焦  35-36
      3.3.2 IPG胶条的平衡  36
      3.3.3 第二向SDS-PAGE  36-37
      3.3.4 银染  37-38
      3.3.5 凝胶图像扫描  38
      3.3.6 双向电泳图谱分析  38
      3.3.7 质谱样品准备及鉴定  38-39
      3.3.8 生物信息学软件分析  39
    3.4 秀丽小杆线虫RNA提取和qRT-PCR  39-41
      3.4.1 秀丽小杆线虫的获取  39-40
      3.4.2 秀丽小杆线虫RNA提取  40
      3.4.3 秀丽小杆线虫RNA检测  40
      3.4.4 qRT-PCR检测  40-41
    3.5 Cry6Aa2晶体蛋白对秀丽小杆线虫突变体的毒力测定  41-42
第三章结果与分析  42-56
  1 Cry6Aa2对根结线虫的作用  42-45
    1.1 Cry6Aa2晶体蛋白的提取及纯化  42-43
    1.2 Cry6Aa2对根结线虫虫卵孵化率的抑制  43
    1.3 Cry6Aa2对二龄根结线虫的毒力作用  43-44
    1.4 Cry6Aa2对二龄根结线虫运动的抑制  44
    1.5 Cry6Aa2对二龄根结线虫感染效率的抑制  44-45
  2 秀丽小杆线虫蛋白组的双向电泳分析和质谱鉴定  45-50
    2.1 Cry6Aa2在BL21中的诱导表达  45-46
    2.2 SDS-PAGE检测秀丽小杆线虫蛋白质组  46-47
    2.3 双向结果图包括差异点分析  47-50
  3 差异蛋白质谱鉴定结果及差异蛋白的功能分析  50-52
    3.1 差异蛋白质谱鉴定结果  50
    3.2 差异蛋白的功能分析  50-52
  4 利用qRT-PCR技术,检测差异蛋白点在转录水平上的差异  52-54
    4.1 秀丽小杆线虫总RNA提取检测  52
    4.2 利用qRT-PCR检测处理和对照组秀丽小杆线虫蛋白质组中10种差异蛋白及3种相关蛋白在转录水平上差异  52-54
  5 对秀丽小杆线虫突变体活力测定的结果  54-56
第四章讨论  56-62
  1 Cry6Aa2对南方根结线虫(M.incognita)的作用  56
  2 对Cry6Aa2毒素在对秀丽小杆线虫的作用机理及秀丽小杆线虫防御毒素蛋白机制的初步探讨  56-62
    2.1 热休克蛋白  57-58
    2.2 能量代谢酶  58-60
    2.3 DIM-1蛋白  60
    2.4 与线虫寿命相关的蛋白  60-62
第五章结论与展望  62-63
参考文献  63-71
致谢  71-72
攻读硕士学位期间撰写和发表的论文专利  72-73
课题受资助的基金项目  73-74

利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用

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