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杀线虫真菌的筛选及菌株DF09002的鉴定、发酵优化与产酶特性研究

作　者: 占宝林
导　师: 黄惠琴
学　校: 海南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 真菌 根结线虫 菌株鉴定 发酵优化 杀线虫活性 酶系分析
分类号: S476.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 55次
引　用: 1次
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内容摘要


从海南五指山、阿里山、定安雷鸣等地采集到29份土壤样品,采用平板稀释法分离获得312株真菌。对分离的真菌进行杀线虫活性筛选,并对杀线虫活性最强的菌株DF09002进行了研究。主要研究内容如下：以南方根结线虫二龄幼虫为靶标线虫,首先对312株真菌进行活性筛选,结果发现共有22株具有抗线虫活性(校正死亡率在70%以上),活性菌株占总分离菌株的5.6%,其中菌株DF09002分离自定安雷鸣辣椒根际土样,其杀虫活性最强,校正死亡率达95.3%。复筛时其发酵液对根结线虫也具有较强的杀灭效果,24h内能将供试线虫全部杀死,稀释5倍后校正击倒率仍达68.5%。通过对菌株DF09002的形态特征、培养特征、rDNA-ITS序列测定及其系统发育分析的研究,将菌株DF09002归类为曲霉属黑色组曲霉黑曲霉集合体(genus of Aspergillus niger aggregate)中的一种。对菌株DF09002的最佳发酵条件和培养基组成进行研究。确定菌株DF09002最佳培养基组成及发酵条件为：土豆汁20%,黄豆粉1%,可溶性淀粉1.5%,葡萄糖2%,酵母膏0.75%；初始pH6.5,培养温度28℃,发酵时间以6天为宜,种龄36h,接种量为6%,250mL三角瓶装液量为75mL,摇床转速为200 r/min。对菌株DF09002产酶种类及特性进行研究,测出菌株DF09002可以产生几丁质酶、蛋白酶,不产生纤维素酶。采用福林-酚试剂法测得菌株DF09002的蛋白酶活力为41.63U/mL,采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)测定还原糖的方法测得菌株DF09002的几丁质酶活力为0.67U/mL。进一步实验证明,几丁质酶反应的最适温度为40℃,最适反应pH为6.8；蛋白酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为9.0。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
1 前言  8-23
  1.1 根结线虫的主要种类及其危害与防治  8-14
    1.1.1 根结线虫主要种类  8
    1.1.2 根结线虫的危害  8-9
    1.1.3 根结线虫的防治  9-14
  1.2 食线虫真菌胞外酶研究简况  14-17
    1.2.1 几丁质酶  14
    1.2.2 纤维素酶和木质素酶  14-15
    1.2.3 蛋白酶  15-17
  1.3 我国微生物农药的现状及展望  17-22
    1.3.1 微生物农药研究进展  17-21
    1.3.2 我国微生物农药应用前景  21-22
  1.4 本论文研究的目的、意义与主要内容  22-23
2 材料与方法  23-31
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 主要试剂  23
    2.1.2 主要仪器  23
    2.1.3 培养基  23-24
  2.2 真菌的分离与筛选  24-26
    2.2.1 样品来源  24
    2.2.2 样品处理  24-25
    2.2.3 分离方法  25
    2.2.4 菌株发酵液的制备  25
    2.2.5 杀线虫真菌的筛选  25
    2.2.6 菌株保存  25
    2.2.7 菌株DF09002处理时间对线虫杀伤效果  25-26
    2.2.8 活性菌株DF09002遗传稳定性  26
  2.3 真菌DF09002的分类鉴定  26-27
    2.3.1 培养特征  26
    2.3.2 形态学特征  26
    2.3.3 菌株DF09002的rDNA-ITS序列测定及系统发育分析  26-27
  2.4 菌株DF09002发酵条件优化  27-29
    2.4.1 菌种活化  27
    2.4.2 菌株发酵  27
    2.4.3 发酵液活性测定  27
    2.4.4 培养基组成对菌株DF09002产活性物质的影响  27-28
    2.4.5 培养条件对菌株DF09002产活性物质的影响  28-29
  2.5 菌株DF09002的产酶特性分析  29-31
    2.5.1 产酶种类的鉴定  29
    2.5.2 产酶特性的分析  29-31
3 结果与分析  31-47
  3.1 活性真菌的分离与筛选  31-35
    3.1.1 初筛结果  31-32
    3.1.2 复筛结果  32-33
    3.1.3 菌株DF09002处理时间对线虫杀伤效果  33-34
    3.1.4 菌株DF09002遗传稳定性  34
    3.1.5 菌株DF09002致死线虫的形态分析  34-35
  3.2 菌株DF09002的分类鉴定  35-37
    3.2.1 菌落形态特征  35
    3.2.2 显微形态特征  35-36
    3.2.3 rDNA-ITS的PCR扩增结果  36
    3.2.4 菌株rDNA-ITS序列测定及其系统发育分析  36-37
  3.3 菌株DF09002的发酵优化  37-43
    3.3.1 培养基组成对菌株DF09002产活性物质的影响  37-40
    3.3.2 培养条件对菌株DF09002活性物质的影响  40-43
  3.4 菌株DF09002产酶特性分析  43-47
    3.4.1 菌株DF09002产酶种类  43-44
    3.4.2 酶活力的测定  44
    3.4.3 温度与pH对酶活力的影响  44-47
4 讨论  47-51
  4.1 真菌的分离  47
  4.2 抗线虫活性菌株的筛选  47-48
  4.3 菌株DF09002的分类鉴定  48-49
  4.4 菌株DF09002杀线虫活性物质的初步研究  49-51
5 结论  51-52
参考文献  52-58
缩略词  58-59
附录  59-60
致谢  60

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用 > 昆虫真菌
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