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多重RT-PCR技术检测桃病毒的研究

作　者: 于云
导　师: 吴祖建
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 桃病毒检测多重RT-PCR 实时荧光定量PCR
分类号: S436.621
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

桃树在我国大部分地区广泛栽培。但是,近年来桃树病毒的侵染日益增强,严重影响了桃果树业的正常发展。据报道,侵染桃树的病毒主要有：苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)、李属坏死环斑病毒(PNRSV)和杏假褪绿叶斑病毒(APCLSV),而且这四种病毒在田间还经常发生混合侵染。2011年3月至2012年8月,从我国12个桃产区共采集桃树样品505份,经RT-PCR和ELISA检测,总检出率达24.6%。本研究在利用单重RT-PCR检测桃病毒病害的基础上,建立了一种能同时检测ACLSV、 CGRMV、PNRSV和APCLSV四种病毒的多重RT-PCR技术检测体系。根据四种病毒的核苷酸保守区序列,设计了四对特异性引物,然后对引物浓度、退火温度等条件进行优化,在一个体系中对ACLSV、CGRMV、PNRSV和APCLSV复合侵染的桃样品进行多重PCR扩增,得到了与试验设计相符的四条条带(632bp、439bp、346bp和282bp)。通过对四种病毒进行序列同源性分析,结果表明试验所选引物可以用于多重RT-PCR检测实验,从而验证了多重RT-PCR结果的可靠性。本研究还建立了双重SYBR Green RT-qPCR体系用于检测ACLSV和CGRMV。通过对田间采集的样品进行定量检测,其结果与传统普通PCR和单一实时荧光定量PCR结果一致。对感病的桃样品不同组织内ACLSV和CGRMV基因组RNA、内源基因RPII和UBQ10mRNA进行绝对定量检测,研究发现ACLSV在植物中的含量约为CGRMV的1%,并且ACLSV和CGRMV在枝条韧皮部中的含量较叶片和花中高。本次研究首次应用多重SYBR Green RT-qPCR系统用于植物病毒检测。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
目录  7-10
中英文縮略词  10-11
第一章文献综述  11-18
  1 侵染桃树的4种主要病毒  11-12
    1.1 苹果褪绿叶斑病毒  11
    1.2 樱桃绿环斑驳病毒  11-12
    1.3 李属坏死环斑病毒  12
    1.4 杏假褪绿叶斑病毒  12
  2 桃病毒检测技术的研究  12-16
    2.1 生物学检测方法  12
    2.2 血清学检测方法  12-13
    2.3 电子显微镜检测法  13
    2.4 分子生物学检测法  13-16
      2.4.1 核酸分子杂交技术  13
      2.4.2 双链RNA电泳技术  13-14
      2.4.3 聚合酶链式反应技术  14-16
        2.4.3.1 实时荧光定量聚合酶链式反应技术  14-15
        2.4.3.2 免疫捕获聚合酶链式反应技术  15-16
        2.4.3.3 多重聚合酶链式反应技术  16
    2.5 基因芯片技术  16
  3 多重RT-PCR技术检测法  16-17
    3.1 多重RT-PCR技术原理  16
    3.2 多重RT-PCR技术在生命科学研究中的应用  16-17
    3.3 多重RT-PCR技术的最新进展  17
  4 研究的目的和意义  17-18
第二章我国桃树病毒性病害田间调查及多重RT-PCR检测桃树病毒  18-33
  1 实验材料、试剂及仪器  18-19
    1.1 实验材料  18
    1.2 实验试剂  18
    1.3 主要仪器  18
    1.4 溶液配置  18-19
  2 实验方法  19-24
    2.1 田间病害调查和毒源采集  19
    2.2 采集样品的ELISA病毒鉴定  19-20
    2.3 病毒总RNA提取  20
    2.4 引物设计  20
    2.5 两步法单重RT-PCR反应体系  20-21
    2.6 多重RT-PCR反应体系  21-22
    2.7 目的片段的克隆  22-24
      2.7.1 PCR产物的纯化  22-23
      2.7.2 连接  23
      2.7.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)  23
      2.7.4 转化和筛选  23-24
      2.7.5 重组质粒的鉴定  24
      2.7.6 目的片段的序列测定和同源性分析  24
    2.8 多重RT-PCR检测方法的实际应用  24
  3 结果与分析  24-32
    3.1 我国桃主产区桃病毒侵染发生率调查  24-27
    3.2 多重RT-PCR引物特异性检测与目的序列分析  27-29
    3.3 多重PCR检测体系的优化  29-30
      3.3.1 引物浓度对PCR扩增效果的影响  29
      3.3.2 多重PCR反应循环条件的优化  29-30
    3.4 单一RT-PCR检测灵敏度测定  30-31
    3.5 多重RT-PCR检测灵敏度测定  31
    3.6 多重RT-PCR对桃病毒检测性能测定  31-32
  4 讨论  32-33
    4.1 两步法RT-PCR技术要点  32
    4.2 一步法RT-PCR与两步法RT-PCR方法比较  32-33
第三章 RT-qPCR方法检测ACLSV和CGRMV  33-48
  1 材料与设备  33
    1.1 实验材料  33
    1.2 仪器和试剂  33
  2 实验方法  33-39
    2.1 引物设计  33-34
    2.2 不同桃组织总RNA提取  34
    2.3 目的片段的克隆  34-36
      2.3.1 ACLSV、CGRMV的部分cp基因的克隆  34-35
      2.3.2 PCR产物的纯化  35
      2.3.3 连接  35
      2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  35
      2.3.5 转化和筛选  35
      2.3.6 质粒DNA小量提取  35-36
      2.3.7 重组质粒的线性化  36
    2.4 制备RNA阳性模板  36-37
      2.4.1 体外转录  36-37
      2.4.2 体外转录产物纯化  37
      2.4.3 阳性RNA拷贝数计算及稀释  37
    2.5 SYBR Green-I RT-qPCR反应体系  37-39
      2.5.1 引物浓度优化  37-38
      2.5.2 单重SYBR Green-I RT-qPCR反应体系  38
      2.5.3 双重SYBR Green-I RT-qPCR反应体系  38
      2.5.4 目的基因和内参基因标准曲线的制备  38-39
    2.6 感病桃样品不同组织内RNA的绝对定量  39
  3 结果与分析  39-47
    3.1 SYBR Green-I RT-qPCR引物浓度的优化  39-40
    3.2 标准曲线的制备  40-43
      3.2.1 ACLSV和CGRMV RT-qPCR标准曲线的制备  40-41
      3.2.2 内参基因RPII和UBQ10 RT-qPCR标准曲线的制备  41-43
    3.3 SYBR Green-I RT-qPCR定量方法的应用  43-45
      3.3.1 RT-PCR、单重SYBR Green-I RT-qPCR和双重SYBR Green-IRT-qPCR检测不同桃品种中ACLSV和CGRMV  43-44
      3.3.2 感病桃样品不同组织内RNA的绝对定量  44-45
    3.4 目的基因和内参基因的溶解曲线  45-47
  4 小结  47-48
第四章全文总结  48-50
  1 我国桃树上病毒发生率调查  48
  2 多重RT-PCR检测桃树上四种主要病毒  48
  3 双重SYBR Green-I RT-qPCR检测ACLSV和CGRMV  48-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
硕士期间发表的论文  57

多重RT-PCR技术检测桃病毒的研究

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