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西瓜噬酸菌在非寄主植物种子中的存活及Ⅳ型菌毛相关基因的功能分析

作　者: 武珍
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 西瓜噬酸菌 Ⅳ型菌毛致病性 GFP标记杂草寄生
分类号: S436.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli, Ac）引起的细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch, BFB）,是近年来在西瓜、甜瓜等葫芦科植物生产上的一种严重的病害,主要是产生大量病斑,造成果实腐烂,严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实,造成大量减产,是国际规定的检疫性植物病害之一。目前人们对西瓜噬酸菌的致病相关基因及其致病机理的研究较少,而对于其致病机理的研究对于BFB防治至关重要。目前对BFB的防治基本上防效很低,而且至今还没有有效的防治方法,现在对于Ac病菌的普遍研究认为该病菌主要通过种子传播,但化学药剂处理对种子处理还不能达到预期防治效果,因此猜测除种子传播作为初侵染源外,还有其它传播途径。本实验通过构建荧光菌株来研究杂草是否可以作为Ac病菌的初侵染源,在杂草开花期将Ac病菌直接接种于柱头上,收集种子,从种子中分离病菌,将分离出的病菌再次接种于哈密瓜子叶上,子叶发病情况与野生型基本相同,因此本实验初步证明了Ac病菌可以在杂草种子中存活,并可以再次导致寄主发病,这对实际应用中防治Ac病菌具有重要意义。对于许多革兰氏阴性病原体,Ⅳ型菌毛（Type IV Pili,TFP）的分解会导致毒力的严重丧失,说明菌毛对致病性是至关重要的。TFP是由菌毛亚基组装构建形成的一个螺旋聚合结构,调节不同的细胞功能,包括表面蠕动,微菌落和生物膜的形成,宿主细胞粘附,免疫逃避,细胞信号传导,DNA摄取和转化以及噬菌体的附着。本实验通过构建Ⅳ型菌毛部分基因的突变体,进行致病力测定。通过浸种实验发现其中Aave₃550（pilE）、Aave₃156（pilZ）、Aave₄679（pilA）基因突变体致病力明显减弱。对突变体进行相关功能研究发现：突变体的生长速度没有受到影响,而生物膜形成能力及游动能力明显下降,致病力减弱。构建互补菌株可使其功能部分恢复,致病力也有所恢复。证明Ⅳ型菌毛相关基因与西瓜噬酸菌致病性相关。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一部分文献综述  10-27
  第一章西瓜噬酸菌  11-15
    1 西瓜噬酸菌  11-12
    2 病原菌分类地位、生物学和生理生化特性  12-13
    3 症状特点  13
    4 传播及侵染循环  13
    5 研究现状  13-15
  第二章 Ⅳ型菌毛研究进展  15-25
    1 细菌分泌系统  15-20
      1.1 Ⅰ型分泌系统(T1SS)  15-16
      1.2 Ⅱ型分泌系统(T2SS)  16-17
      1.3 Ⅲ型分泌系统(T3SS)  17
      1.4 Ⅳ型分泌系统(T4SS)  17-18
      1.5 Ⅴ型分泌系统(T5SS)  18-19
      1.6 Ⅵ型分泌系统(T6SS)  19-20
    2 Ⅳ型菌毛  20-25
      2.1 Ⅳ型菌毛的结构  21-22
      2.2 Ⅳ型菌毛的致病机制  22-25
  第三章绿色荧光蛋白标记  25-27
    1 绿色荧光蛋白  25
    2 GFP的应用  25-26
      2.1 作为转基因植物和动物的筛选标记  25-26
      2.2 基因表达及产物定位  26
      2.3 用于免疫学,临床检验  26
      2.4 GFP还可以追踪微生物在体内的感染途径,病毒和宿主的相互作用  26
    3 植物与微生物之间的相互作用  26
    4 GFP应用的展望  26-27
第二部分研究内容  27-59
  第一章西瓜噬酸菌在非寄主植物中寄生的研究  29-41
    摘要  29
    1 材料与方法  29-32
      1.1 供试菌株和质粒及其培养条件  29-30
      1.2 主要试剂和仪器  30
      1.3 试剂  30
      1.4 培养基  30-31
      1.5 菌株的培养条件及保存  31
      1.6 引物  31-32
    2 试验方法  32-36
      2.1 细菌基因组DNA的提取  32-33
      2.2 PCR扩增及产物回收  33
      2.3 质粒的提取  33-34
      2.4 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  34
      2.5 大肠杆菌热击感受态的制备和转化  34-35
      2.6 荧光的构建  35
      2.7 荧光标记菌株的验证  35-36
      2.8 荧光标记菌在非寄主中存活的研究  36
      2.9 杂草种子分离的菌株的致病性  36
    3 结果与分析  36-40
      3.1 构建好的荧光标记菌株  36-37
      3.2 生长曲线  37-38
      3.3 对致病性没有影响  38
      3.4 荧光标记菌在杂草中存活  38-39
      3.5 杂草种子分离的菌株的致病性  39-40
    4 讨论  40-41
  第二章西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛相关基因的功能研究  41-59
    摘要  41-42
    1 材料与方法  42-46
      1.1 供试菌株和质粒及其培养条件  42-43
      1.2 主要试剂和仪器  43
      1.3 试剂  43-44
      1.4 培养基  44
      1.5 菌株的培养条件及保存  44
      1.6 引物  44-46
    2 试验方法  46-48
      2.1 细菌基因组DNA的提取  46
      2.2 PCR扩增及产物回收  46
      2.3 质粒的提取  46
      2.4 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  46
      2.5 大肠杆菌热击感受态的制备和转化  46
      2.6 突变体的构建和互补菌株的构建  46
      2.7 致病性测定  46
      2.8 在MMX培养基中的生长测定  46-47
      2.9 细菌胞外纤维素酶的检测  47
      2.10 细胞形态观察  47
      2.11 游动性实验  47
      2.12 生物膜形成测定  47
      2.13 烟草过敏性反应(HR)测定  47-48
    3 结果和分析  48-56
      3.1 突变株及互补菌株构建  48-50
      3.2 各突变体对致病性的影响  50-51
      3.3 突变菌株不影响果斑菌的生长  51-52
      3.4 基因突变不影响细菌胞外纤维素酶  52-53
      3.5 基因突变影响了西瓜噬酸菌的Ⅳ型菌毛合成  53
      3.6 基因突变影响西瓜噬酸菌的游动性  53-54
      3.7 基因突变影响西瓜噬酸菌的生物膜形成  54-55
      3.8 基因突变不影响细菌激发烟草过敏性反应  55-56
    4 讨论  56-59
参考文献  59-67
附录  67-75
致谢  75

西瓜噬酸菌在非寄主植物种子中的存活及Ⅳ型菌毛相关基因的功能分析

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