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南美白对虾肌肉精氨酸氨肽酶的分离纯化及性质分析

作　者: 张玲
导　师: 曹敏杰
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 南美白对虾精氨酸氨肽酶肽指纹图谱性质分析酶动力学
分类号: TS254.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

南美白对虾（Litopenaeus vannamei）是当今世界上养殖产量最大的三大虾类之一，因其营养丰富、肉质鲜美，深受人们的喜爱。虾具有其特征性的风味，这种特征性风味是由前体物质经化学变化产生的，而游离精氨酸是产生特征性虾风味的一种主要前体物质。精氨酸氨肽酶（Arginine aminopeptidase，RAP）是一种从N端特异性切割碱性氨基酸的氨肽酶，广泛分布于动物、植物及微生物中。在动物肌肉组织中，RAP能够与内肽酶协同作用，分解蛋白质及多肽产生游离的碱性氨基酸（Arg和Lys），以利于肉及肉制品风味的形成。本文以南美白对虾为研究对象，通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及hydroxyapatite柱层析从其肌肉中分离纯化得到精氨酸氨肽酶，并对其生物化学性质进行了分析研究。（1）从350g南美白对虾肌肉中纯化得到0.6mg RAP，得率为7.7%，纯化倍数为1953.3。SDS-PAGE电泳分析表明，RAP的分子量约为100kDa。（2）利用肽质量指纹图谱对得到的目的蛋白进行鉴定，共得到7个肽段，含95个氨基酸残基，这些片段的序列与豌豆蚜虫（Acyrthosiphon pisum）和斑马鱼（Danio rerio）氨肽酶的序列相似性分别为100%和77.9%，结合底物特异性，表明纯化得到的酶为精氨酸氨肽酶。（3）南美白对虾RAP的最适pH为7.0，最适温度为30℃，其在低温及中性或弱酸性条件下酶活性较高，且较为稳定。通过热失活动力学的方法测定了该酶的表观热失活速率常数，表明温度越高，其失活的速率越快；微观热失活速率常数的测定表明该酶在热失活的过程中存在底物保护作用。（4）RAP最易分解荧光底物Arg-MCA和Lys-MCA。此外，对Leu-MCA也有一定的分解作用，但是对内肽酶的底物没有分解。利用双倒数作图法，以Arg-MCA和Lys-MCA为底物，分别测定RAP的Km值为2.7和4.9μmol/L，kcat/Km值为6.7和4.2μmol-1·L·s-1，进一步表明该酶的最适底物是Arg-MCA。（5）氨肽酶的抑制剂puromycin， bestatin和金属蛋白酶抑制剂1,10-phenanthroline能够强烈抑制该酶的活性。此外，金属螯合剂EDTA和EGTA也能够部分抑制该酶的活性，但其他类型蛋白酶抑制剂（E-64，PMSF，pepstatinA）对该酶的活性无抑制作用，表明该氨肽酶属于金属蛋白酶家族。采用动力学的方法研究puromycin对RAP的抑制作用表明，puromycin对该酶的抑制作用属于竞争性抑制，抑制常数Ki=0.07nmol/L。（6）不同二价金属离子对RAP活性的影响不同，RAP经EDTA充分透析后，活性丧失70%，而添加Zn²⁺和Mn²⁺后，可将丧失的酶活几乎完全恢复，表明RAP的活性中心可能结合Zn²⁺和（或）Mn²⁺。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第1章引言  10-18
  1.1 氨肽酶  10-14
    1.1.1 氨肽酶的分类  10-11
    1.1.2 氨肽酶的功能与应用  11-13
    1.1.3 精氨酸氨肽酶  13-14
  1.2 南美白对虾  14-16
    1.2.1 营养价值  15
    1.2.2 生产概况  15-16
    1.2.3 新鲜虾的特征风味  16
  1.3 本研究的目的与意义  16-18
第2章材料与方法  18-32
  2.1 材料  18-22
    2.1.1 实验原料  18
    2.1.2 实验试剂  18-19
    2.1.3 实验所用溶液及配制  19-22
    2.1.4 主要仪器  22
  2.2 实验方法  22-32
    2.2.0 精氨酸氨肽酶活力的测定  22-23
    2.2.1 蛋白浓度的测定  23
    2.2.2 SDS-PAGE 及 Native-PAGE  23-24
    2.2.3 硝酸银染色法  24-25
    2.2.4 南美白对虾精氨酸氨肽酶的分离纯化  25-28
    2.2.5 分子量的确定及纯度的鉴定  28
    2.2.6 肽质量指纹图谱  28-29
    2.2.7 最适 pH 及 pH 稳定性  29
    2.2.8 最适温度及热稳定性  29
    2.2.9 热失活动力学  29-30
    2.2.10 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响  30
    2.2.11 金属离子对酶活性的影响  30
    2.2.12 底物特异性的研究  30
    2.2.13 酶动力学参数的测定  30-31
    2.2.14 酶催化 Arg-MCA 水解反应活化能的测定  31-32
第3章结果与分析  32-52
  3.1 RAP 的分离纯化  32-35
  3.2 RAP 的性质分析  35-52
    3.2.1 电泳分析  36
    3.2.2 肽质量指纹图谱  36-39
    3.2.3 pH 对酶活性的影响  39
    3.2.4 温度对酶活性的影响  39-40
    3.2.5 酶的热失活动力学  40-44
    3.2.6 底物特异性的研究  44
    3.2.7 RAP 动力学参数的测定  44-45
    3.2.8 活化能的测定  45-46
    3.2.9 蛋白酶抑制剂对 RAP 的作用  46-49
    3.2.10 金属离子对酶活性的影响  49-52
第4章讨论  52-57
第5章结论与展望  57-59
  5.1 主要结论  57-58
  5.2 展望  58-59
参考文献  59-66
附录  66-67
致谢  67-68
在校期间发表的论文  68

南美白对虾肌肉精氨酸氨肽酶的分离纯化及性质分析

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