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菜粉蝶颗粒体病毒hel和sod基因的克隆、转录和表达研究

作　者: 欧融
导　师: 陈保善
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 菜粉蝶颗粒体病毒 helicase基因 sod基因转录分析
分类号: S476.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 15次
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内容摘要

基因克隆和序列分析表明，菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae granulovirus，PiraGV)解旋酶基因(hel)编码一个1133个氨基酸、预计分子量为133kD的蛋白质。PiraGV解旋酶基因存在一般解旋酶7个保守基元中的四个(MotifⅠ、Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ)。5’-RACE表明，hel的转录起始位点位于翻译起始密码子的-214位的胸腺嘧啶，3’-RACE表明，poly(A)加入位点在翻译终止密码子后116位碱基。同源性比较发现，PiraGV解旋酶基因的氨基酸序列与苹果异形小卷蛾颗粒体(Cryptophlebia leucotreta granulovirus，CrleGV)同源性最高(56.3％)，与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)同源性最低(20.0％)。定量PCR显示，PiraGV hel在感染宿主后24h～36h开始转录，至96h达到高峰，120h转录水平下降。PiraGV的超氧歧化酶基因(sod)编码156个氨基酸的蛋白质。5’-RACE表明，sod的转录起始位点位于翻译起始密码子的-159位的胸腺嘧啶，3’-RACE表明，poly(A)加入位点在翻译终止密码子后615位碱基。同源性比较发现，与云杉卷叶蛾颗粒体病毒(Choristoneura fumiferana granulovirus，CfGV)的SOD同源性最高(65.8％)，与棉褐带卷蛾颗粒体病毒(Adoxophyes orana granulovirus AdorGV)SOD同源性最低(50.5％)。PiraGV sod在感染宿主24h～36h开始转录，96h达到高峰，120h转录水平下降。对sod进行原核表达，测得总酶活力为3.58×10~4U／mg。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-8
第一章前言  8-19
  1.1 昆虫杆状病毒研究进展  8-16
    1.1.1 昆虫杆状病毒的分类  8
    1.1.2 已测定全序列的昆虫杆状病毒  8-10
    1.1.3 昆虫杆状病毒的应用  10-11
      1.1.3.1 昆虫杆状病毒表达载体  10
      1.1.3.2 重组病毒杀虫剂  10-11
    1.1.4 昆虫杆状病毒的功能基因  11-16
      1.1.4.1 与病毒复制有关的基因  11-13
      1.1.4.2 与病毒DNA表达调节有关的基因  13-14
      1.1.4.3 与辅助功能有关的基因  14-15
      1.1.4.4 与病毒结构有关的基因  15-16
      1.1.4.5 与抗细胞凋亡有关的基因  16
  1.2 菜粉蝶颗粒体病毒的研究进展  16-18
    1.2.1 菜粉蝶发生及危害情况  16-17
    1.2.2 已鉴定的菜粉蝶颗粒体病毒功能基因  17-18
      1.2.2.1 颗粒体蛋白(Granulin)  17
      1.2.2.2 晚期表达因子lef-8、lef-9及ac22-like protein、polyhedrin／granulin  17-18
  1.3 本研究的目的及意义  18-19
第二章材料与方法  19-32
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 菜粉蝶颗粒体病毒  19
    2.1.2 菌株与质粒  19
    2.1.3 培养基及菌株培养条件  19
      2.1.3.1 培养基配置  19
      2.1.3.2 菌株培养条件  19
    2.1.4 抗生素配制  19-20
    2.1.5 酶、化学试剂  20
  2.2 病毒接种  20
    2.2.1 无病毒菜粉蝶群落的建立  20
    2.2.2 病毒纯化和接种  20
  2.3 常规分子生物学操作方法  20-32
    2.3.1 总RNA的提取  20-21
      2.3.1.1 异硫氰酸胍变性法  20-21
      2.3.1.2 Trizol法  21
    2.3.2 凝胶电泳  21-22
    2.3.3 PCR反应体系  22
    2.3.4 菜粉蝶颗粒体病毒hel RACE  22-24
      2.3.4.1 hel 3’RACE  22-23
      2.3.4.2 hel 5’RACE  23-24
    2.3.5 菜粉蝶颗粒体病毒sod RACE  24-25
    2.3.6 从凝胶中回收目的DNA片段  25-26
    2.3.7 DNA连接反应  26
    2.3.8 质粒DNA的转化  26-27
      2.3.8.1 甘油法快速制备E.coli的感受态细胞  26
      2.3.8.2 RbCl_2制备大肠杆菌感受态细胞  26-27
      2.3.8.3 质粒DNA的电脉冲转化  27
      2.3.8.4质粒DNA的热冲击转化  27
    2.3.9 质粒DNA的提取  27-28
    2.3.10 内切酶反应  28
    2.3.11 荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)  28-29
    2.3.12 粉蝶颗粒体病毒sod原核表达  29-32
第三章 PiraGV hel基因  32-48
  3.1 结果与分析  32-46
    3.1.1 PiraGV hel基因的定位与克隆  32
    3.1.2 感染了PiraGV的宿主总RNA的浓度及质量  32-33
    3.1.3 PiraGV hel RACE  33-35
    3.1.4 PiraGV hel全长cDNA序列及推导的氨基酸序列  35-38
    3.1.5 PiraGV hel氨基酸同源性比较  38-44
    3.1.6 PiraGV hel系统进化树分析  44-45
    3.1.7 PiraGV hel转录的荧光定量PCR分析  45-46
  3.2 讨论  46-48
第四章 PiraGV sod基因  48-57
  4.1 结果与分析  48-55
    4.1.1 PiraGV sod基因克隆与定位  48
    4.1.2 PiraGV sod 3′RACE和5′RACE  48-50
    4.1.3 PiraGV sod全长cDNA序列及氨基酸序列  50-51
    4.1.4 PiraGV SOD氨基酸同源性比较  51-53
    4.1.5 PiraGV sod转录的荧光定量PCR的分析  53-54
    4.1.6 SOD原核表达  54-55
  4.2 讨论  55-57
参考文献  57-67
附录1 缩略词及中文对照  67-68
附录2 常用培养基、溶液及其配制  68-69
附录3 实验中用到的主要仪器  69-70
致谢  70-71
攻读硕士学位期间发表的学术论文  71

菜粉蝶颗粒体病毒hel和sod基因的克隆、转录和表达研究

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