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药用黄连的分子系统学和保护遗传学研究

作　者: 胡娟
导　师: 邵爱娟；黄璐琦；袁庆军；宋良科
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中药学
关键词: 药用黄连分子系统学栽培起源峨眉黄连 SSR 群体遗传分析保护遗传
分类号: S567.52
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

中国黄连属的叶掌状三全裂组,按中国植物志从形态上分为4种1变种,分别是峨眉黄连、三角叶黄连、云南黄连、黄连及短萼黄连。这五个种在系统分类上,尤其是栽培起源上存在争议与困惑。目前,黄连与三角叶黄连均为栽培品,栽培起源不清；峨眉黄连仅在峨眉山核心地区有分布,濒危严重；云南黄连分布在云南、西藏的高海拔地区,为渐危种；短萼黄连野生种质的分布区域较广,也因地方作黄连代用品使资源量不断减少而列为渐危种。本研究采集的样品包括了这五个种,其中,峨眉黄连、短萼黄连为野生品,云南黄连为野生移栽品,而三角叶黄连与黄连均为栽培品。本研究对采集的226个样品进行分子系统学研究,采用叶绿体DNA序列分析(cpSNP)方法,选用叶绿体非编码区的两个片断psbA-trnH以及trnL-trnF,两个片断的变异位点数分别为23及9个,共得到17个单倍型。将所有样品序列构建网状进化树并进行单倍型分布分析,得出以下结论：1)黄连属的叶掌状三全裂组形成三个明显分支,一支是遗传距离最远的云南黄连；一支是以峨眉黄连为主,伴有部分栽培品；另一支保留了较多单倍型,并均为栽培品。2)由于峨眉山独特的地理结构,生长其中的峨眉黄连,分成两个明显的亚分支。从单倍型在栽培居群的分布情况看,黄连与三角叶黄连存在栽培种质混乱的问题。三角叶黄连中单倍型频率最高的单倍型H,与峨眉黄连单倍型A之间仅一个碱基的变异,并且三角叶黄连居群DCZX均为单倍型A,推测三角叶黄连栽培起源于峨眉黄连；其中,三角叶黄连居群DCZX,即“草连”,中裂片较长与峨眉黄连相似并与峨眉黄连具有相同单倍型A,应为峨眉黄连的栽培变种。栽培历史较长并广泛栽培的黄连保留了较丰富的单倍型,并处于峨眉黄连外的另一分支,因此推测,黄连栽培起源于峨眉黄连外的另一个种(其祖先种已消失),并由古人引种栽培驯化而来。短萼黄连与黄连单倍型F之间仅有4步的变异,其从形态上处理为黄连变种得到了遗传上的证实。对此,作者进行了黄连历代本草文献记载的整理,发现除“云连”或“滇连”,即云南黄连少有记载外,古代记载的黄连从汉晋开始,均为两个种,一个是“粗大节平”,另一个是“节如连珠”,与现在栽培的两个种有关,即三角叶黄连与黄连。黄连的栽培史记载,“鸡爪连”即黄连,栽培种质来源于重庆巫溪并以种子繁殖,《名医别录》记载黄连生巫阳川谷及蜀郡、太山(巫阳即今重庆巫山),推测巫山一带极有可能是古代黄连栽培的种质来源地。从洪雅栽培三角叶黄连的历史记载,并从峨眉黄连在洪雅有分布记载,进一步证实了三角叶黄连栽培起源于峨眉黄连。并且,古代本草记载的很多黄连野生种质分布点现已经消失,与现在黄连野生种质资源进一步缩小的趋势一致。本研究首次对药用植物峨眉黄连进行了SSR引物开发,使用五对荧光SSR引物对峨眉黄连的六个野生居群及一个野生移栽居群进行居群内与居群间的遗传多样性,遗传结构及基因流分析。研究结果表明,峨眉黄连存在较丰富的遗传多样性(A=4.7；Ho=0.397；HE=0.588),可能与其地理结构复杂有关。STRUCTURE软件分析得出峨眉黄连主要存在两大遗传群体,与叶绿体分析数据一致,从两组数据的分析比较得出,两大群体之间曾存在广泛的基因交流,但主要为花粉流,并未发现有种子流。使用软件BOTTLENECK分析,六个野生居群中有四个显示出杂合过度,表明这些居群近期遭遇了遗传瓶颈,可能与90年代峨眉黄连的大规模采挖破坏有关。居群片断化分布后对峨眉黄连遗传方式的影响较大,主要表现为居群间基因流减少、遗传分化显著以及近交衰退现象。居群间的基因流系数减少(Nm= 0.8812)、AMOVA分析显示各片断化居群间遗传分化显著,在四个居群中,即CDC, SDH, BY及RTZ,居群内近交系数FIS较高并显著偏离了哈迪-温伯格平衡。临近同一水域的居群SW和LD两个居群间存在种子流,其观测杂合度Ho较高、近交系数FIS小,提示我们水流有助于居群间的基因交流,减少居群内的近交衰退及居群间的遗传分化。而近年来在峨眉山地区截流建立水电站,生境破坏严重,势必对峨眉黄连的繁衍产生不可估量的影响。基于以上研究分析,作者提出了峨眉黄连野生种质的保护策略,主要包括峨眉山自然保护区保护、建立种质资源库以及加强法律保障三个方面。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一章前言  11-25
  1.1 黄连古今药用情况和种质资源与栽培现状  11-16
    1.1.1 黄连古代药用情况  11-14
    1.1.2 黄连的栽培历史  14-15
    1.1.3 黄连种质资源与药用、栽培现状  15-16
  1.2 黄连属的分类简史  16-17
  1.3 峨眉山的地质特点、特有现象及崖生植物  17-19
  1.4 濒危植物与保护遗传学  19-22
  1.5 分子系统学与分子标记技术  22-24
  1.6 本研究的目的和意义  24-25
第二章黄连属的系统分类及样品采集  25-29
  2.1 黄连的分类鉴定  25-26
  2.2 峨眉黄连野生居群及其生境  26-27
  2.3 本研究样品采集  27-29
第三章黄连的分子系统学研究  29-36
  3.1 实验材料  29
  3.2 实验方法  29-31
    3.2.1 总DNA提取  29
    3.2.2 PCR扩增和测序  29-30
    3.2.3 引物筛选  30
    3.2.4 数据分析  30-31
  3.3 结果  31-34
    3.3.1 黄连属叶绿体片断的变异及单倍型分布  31-33
    3.3.2 单倍型网状进化树  33-34
  3.4 讨论  34-36
第四章峨眉黄连微卫星引物开发  36-50
  4.1 实验材料与实验方法  37-45
    4.1.1 实验材料  37
    4.1.2 酶切连接反应及PCR扩增  37-39
    4.1.3 用Dynabead富集微卫星DNA片段  39-42
    4.1.4 富含微卫星DNA片段的克隆  42-43
    4.1.5 菌液PCR扩增与测序  43-44
    4.1.6 微卫星序列引物设计及多态性检测  44-45
  4.2 结果与讨论  45-50
第五章峨眉黄连的SSR 群体遗传分析与保护遗传学研究  50-59
  5.1 实验材料与方法  51-54
    5.1.1 实验材料  51-52
    5.1.2 实验方法  52-54
  5.2 实验结果与分析  54-57
    5.2.1 荧光检测结果  54
    5.2.2 峨眉黄连遗传多样性与近交系数  54-55
    5.2.3 峨眉黄连的群体遗传结构分析  55-57
  5.3 峨眉黄连的保护策略  57-59
第六章小结  59-62
  6.1 cPSNP及SSR数据分析峨眉黄连的遗传结构  60
  6.2 黄连属种质资源的保护  60-61
  6.3 峨眉黄连与三角叶黄连  61-62
参考文献  62-65
硕士期间已发表和待发表论文  65-66
致谢  66-68

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