学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

转氨酶ATA117在大肠杆菌中的高效重组表达及催化制备西他列汀

作　者: 王璐
导　师: 徐刚
学　校: 浙江大学
专　业: 化学工程
关键词: 转氨酶重组表达响应面优化西他列汀
分类号: TQ463
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 83次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

转氨酶ATA117在合成手性胺类药物西他列汀中具有重要用途,本论文构建了不同的表达体系,优化表达条件,以实现ATAT117的高效表达,并对重组转氨酶的发酵工艺和产品西他列汀的制备工艺进行研究。我们首先以E.coli BL21(DE3)作为宿主,构建了PBV220-ATA117, pCDFDuet-ATA117, pETDuet-ATA117和pRSFDuet-ATA117四种重组载体,从蛋白表达水平和催化活力上进行了考察,选出表达能力较高的载体pETDuet-ATA117,其活力为137U/L,比活为0.24U/mg粗蛋白。对重组转氨酶的酶学性质进行了表征,其最适pH为9.0,在pH7.0-10.0的范围内都表现出很高的稳定性,该酶同时也具有很好的热稳定性,在反应温度45℃时,酶活力半衰期达到47.8h,在常温下,半衰期超过100h。为了提高Eco(pETDuet-ATA117)的发酵酶活,我们先使用单因素法和响应面法结合的方式对培养基成分进行了优化,得到最佳培养基配方：甘油14.45g/L,酵母粉7.27g/L,胰蛋白胨5.72g/L, NaC110g/L, K2HP044g/L。在优化培养基的基础上又对诱导条件进行了研究,最适诱导条件下酶活为713.7U/L。随后进行了lOL发酵罐中的分批和补料发酵工艺研究,最终菌体密度达到29.78g/L,酶活力达到3971U/L,比LB培养基发酵提高了30多倍。通过制备工艺的优化,50g/L底物浓度时,最佳的助溶剂为40%的DMSO,最佳的底物：细胞：辅酶比例为50：12.5：0.37,在此比例下,采用全细胞催化,8h可将底物完全转化为西他列汀,ee>99.95%。随后对产物西他列汀的分离纯化工艺进行了初步探索,最终收率达到80%。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-28
  1.1 生物催化制备手性胺  12-16
    1.1.1 外消旋胺的动力学拆分(KR)  12-14
    1.1.2 胺的动态动力学拆分(DKR)  14-15
    1.1.3 转氨酶不对称合成手性胺  15-16
  1.2 转氨酶简介  16-22
    1.2.1 转氨酶的分类  17-19
    1.2.2 转氨酶的催化机制  19
    1.2.3 ω-转氨酶的应用  19-22
  1.3 西他列汀  22-26
    1.3.1 西他列汀的化学名称及结构  23
    1.3.2 西他列汀的药理作用  23-24
    1.3.3 西他列汀的合成  24-26
  1.4 本课题的研究思路与主要内容  26-28
第二章转氨酶基因的克隆和重组表达  28-50
  2.1 引言  28
  2.2 材料与方法  28-43
    2.2.1 菌种与质粒  28-31
    2.2.2 实验仪器  31-33
    2.2.3 药品与试剂  33-35
    2.2.4 实验方法  35-41
    2.2.5 分析方法  41-43
  2.3 实验结果与讨论  43-48
    2.3.1 PCR获取基因  43-44
    2.3.2 目的基因和四种质粒的双酶切  44-45
    2.3.3 重组质粒的构建及验证  45-46
    2.3.4 四种重组质粒的蛋白表达情况  46-47
    2.3.5 重组菌活力的验证  47-48
  2.4 本章小结  48-50
第3章重组转氨酶的酶学性质研究  50-58
  3.1 引言  50
  3.2 材料与方法  50-52
    3.2.1 实验仪器  50
    3.2.2 实验药品  50-51
    3.2.3 重组大肠杆菌发酵培养及产酶  51
    3.2.4 重组转氨酶ATA117的酶学性质研究  51-52
  3.3 结果与讨论  52-57
    3.3.1 转氨酶的最适pH  52
    3.3.2 酶的酸碱稳定性  52-54
    3.3.3 转氨酶的最适温度  54
    3.3.4 酶的热稳定性  54-55
    3.3.5 金属离子和EDTA对转氨酶活力的影响  55-56
    3.3.6 转氨酶ATA117全细胞酶活和粗酶液酶活的比较  56-57
  3.4 本章小结  57-58
第4章重组工程菌的发酵工艺研究  58-79
  4.1 引言  58
  4.2 材料和方法  58-60
    4.2.1 实验材料  58-59
    4.2.2 培养基  59
    4.2.3 培养方法  59
    4.2.4 分析方法  59-60
  4.3 实验结果和讨论  60-77
    4.3.1 单因素优化培养基  60-63
    4.3.2 二水平因子设计法筛选产酶的重要因素  63-64
    4.3.3 最陡爬坡实验(steepest ascent design)  64-65
    4.3.4 中心组和设计和响应面法确定培养基组分的浓度  65-69
    4.3.5 最适诱导条件的确定  69-73
    4.3.6 高密度发酵工艺研究  73-77
  4.4 本章小结  77-79
第五章重组转氨酶催化制备西他列汀的工艺研究  79-89
  5.1 引言  79
  5.2 材料和方法  79-80
    5.2.1 实验材料  79
    5.2.2 催化剂的制备  79-80
    5.2.3 分析方法  80
  5.3 结果与讨论  80-87
    5.3.1 助溶剂种类的选择  80-81
    5.3.2 DMSO浓度的选择  81-82
    5.3.3 细胞负载量的考察  82
    5.3.4 辅酶浓度的优化  82-83
    5.3.5 底物浓度的考察  83-84
    5.3.6 产品的分离与纯化  84-85
    5.3.7 产品的鉴定  85-87
  5.4 本章小结  87-89
第六章结论与展望  89-91
  6.1 结论  89-90
  6.2 展望  90-91
参考文献  91-96
附录  96-97
作者简介  97

转氨酶ATA117在大肠杆菌中的高效重组表达及催化制备西他列汀

内容摘要

全文目录

相似论文