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寡聚荷正电氨基酸修饰的基因递送纳米脂质载体的构建和初步评价

作　者: 张雪敬
导　师: 曹德英；向柏
学　校: 河北医科大学
专　业: 药剂学
关键词: 细胞穿膜肽基因载体纳米脂质载体流式细胞术细胞摄取效率
分类号: R943
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：脂质体已经成为生物医药技术领域里，最主要的药物、基因、影像剂的重要载体，是一种非病毒载体类载体，在基因传递中具有显著优势。但仍然存在生物大分子负载率低、摄取效率低、胞内释放性能欠佳、内涵体逃逸障碍等问题。因此，本文重在设计一种多能高效的生物大分子输送载体。本文合成了能高效提高转染效率的DC-Chol，以及赋予脂质体pH敏感性能的CHEMS，对其化学结构进行表征。将DSPE-PEG(2000)与CPP共轭连接，得到导向性脂材DSPE-PEG-CPP，以提高脂质体对细胞的摄取能力。构建了一种能使siRNA冲破内涵体逃逸障碍，避免被溶酶体灭活的CPP修饰载压缩物脂质体CL2，和一种CPP修饰的非载压缩脂质体CL1，并对其进行表征和初步的评价。方法：1胆固醇氯甲酸酯和过量N，N-二甲基乙二胺分别溶于无醇氯仿中，0-4℃冰水浴条件下反应。TLC监测反应进程，待胆固醇氯甲酸酯反应完全后终止反应（约2h），旋蒸挥干溶剂，干燥后用热绝对乙醇重结晶两次纯化并真空干燥。2胆固醇与过量的丁二酸酐溶于20mL甲苯， DMAP作为催化剂，加热回流反应3h。旋转蒸发挥干溶剂，干燥后重结晶两次，得到灰色产品。3Mal-PEG-DSPE用氯仿-甲醇（3:1）溶解，旋转成膜，HBS(pH6.5)溶液3.0mL水化，和CPP肽溶液（5mg溶于HBS(pH6.5)2.0mL）混合，搅拌反应48h，加入半胱氨酸适量继续搅拌4h，透析2d，冷冻干燥。4空白脂质体单因素考察，通过固定膜材总量；DOPE:CHEMS比例的筛选；添加Chol对制剂的影响；水化液选择；超声时间的选择，最终确定空白脂质体制备方法。5构建非压缩载药脂质体（NL1/CL1）和载压缩物脂质体（NL2和CL2），并进粒径、电位和电镜表征。制备方法如下：分别以DSPE-PEG、DSPE-PEG（CPP）成膜，DEPC水溶液水化，超声得胶束M1、M2。非压缩载药脂质体（NL1/CL1）：以SPC/Chol/DC-Chol为脂材成膜，含siRNA的DEPC溶液水化脱膜，水浴超声10-15min，得到普通载药脂质体。通过后插入法分别与胶束M1和M2孵育4h，得NL1和CL1。载压缩物脂质体（NL2和CL2）：以DOPE/CHEMS/Chol为脂材成膜，DEPC水化液脱膜，超声得空白脂质体，与siRNA压缩物混合孵育后,冰浴条件调至pH7.4-7.8，再通过后插入法制备NL2和CL2。6以流式细胞术分析包载siRNA的NL1＆CL1和包载压缩siRNA的NL2＆CL2处理的MCF-7细胞，以阳性细胞百分数和胞内平均荧光强度（MFI）为考察指标，评价细胞摄取效率。结果：1合成DC-Chol：白色固体粉末1.621g,产率达到60.3%;熔点:107-108℃;TLC(氯仿-甲醇=65：35（v/v）,10%H2SO4显色)， Rf=0.56，显示为纯品;质谱图中m/z501.6，与DC-Chol的理论计算值501.80（M+H+）相符；1HNMR：δ,2.301（s，6H）；δ，2.495（t，2H）； δ，3.305，3.296（q，2H）；δ，5.365（s，1H)。证明产物结构正确。2合成CHEMS：将无水乙醇重结晶干燥后，得到浅灰色固体粉末0.49g，产率78%；熔点：173-176℃；TLC测定（氯仿：甲醇（10:1，v/v），新生成斑点Rf=0.10，显示为纯品；质谱图中有离子峰m/z485.5，与CHEMS的理论计算值为485.5（M-H+）相符。证明产物结构正确。3合成DSPE-PEG-CPP：得到白色絮状物；通过Ellman试剂测得CPP反应率为84.4%；MS+检测，分子离子峰m/z4469.17，与设计肽平理论计算值相对应。证明产物为目标化合物为DSPE-PEG-CPP。4通过单因素考察，确定脂质体制备工艺：精密量取DOPE、CHEMS、Chol按5:2:2（mol/mol/mol）成膜，加入37℃DEPC水溶液2.0mL水化，超声10-15min，得到带有淡蓝色乳光的半透明体系，测粒径。5构建了非压缩载药脂质体（NL1/CL1）和载压缩物脂质体（NL2和CL2），并进粒径、电位和电镜表征。NL1、CL1的粒径分别为226.8nm、262.4nm；后者PdI较小，粒径分布窄;Zeta分别为37.0mV、55.7mV，体系稳定；电镜下观察，粒径约200nm左右。NL2、CL2粒径分别为289.8nm、293.2nm；两组制剂PdI都很小，粒径分布窄；Zeta分别为-29.6mV、-29.2mV，脂质体表面带负电，体系趋于稳定;电镜下观察，粒径约200nm左右。6采用流式细胞分析术分析经药物制剂处理的细胞悬液非压缩制剂组N-L和C-L进入细胞的荧光强度X-mean分别为9.1,10.4，是阴性对照组和游离siRNA组的20倍左右，由此说明CPP修饰非压缩载药脂质体（C-L制剂）、普通修饰非压缩载药脂质体（N-L）均提高了细胞摄取率，CPP修饰非压缩载药脂质体具有更高的细胞摄取率。载压缩物制剂组N-L’、C-L’阳性细胞百分比为6.4%、7.9%，其阳性细胞百分数均有显著变化，提高细胞摄取效率约10倍，表明载压缩物制剂均提高了细胞摄取效率，CPP修饰载压缩物脂质体具有更高的细胞摄取率。结论：实验结果表明，DC-Chol以及CHEMS合成路线可靠，产率分别为60.3%、78%，产品纯度较高，重现性高。由Ellman试剂判断反应进程，质谱测定得出的分子离子峰推测产物结构，成功地将CPP共轭连接到DSPE-PEG（2000）中的PEG远端，得到增强细胞穿透能力的导向性脂材DSPE-PEG（2000）-CPP。成功地制备了四组递送siRNA的递送纳米脂质载体CPP修饰非压缩载药脂质体（NL1）、普通修饰非压缩载药脂质体（NL2）、普通修饰在压缩物脂质体（CL1）、CPP修饰载压缩物脂质体（CL2）。四组制剂均提高了细胞摄取效率。普通脂质体与CPP修饰的脂质体的细胞摄取相对较高，但差异并不显著。导致这个结果的可能的原因是，如DSPE-PEG-CPP合成产物中有较多剩余脂材原料，反应条件有待进一步优化，产物纯度有待提高。

全文目录

摘要  5-9
ABSTRACT  9-14
引言  14-16
第一部分载体材料 DC-Chol/CHEMS 的合成  16-25
  前言  16-17
  材料与方法  17-18
  结果  18-20
  附图  20-23
  讨论  23
  小结  23
  参考文献  23-25
第二部分导向性脂材（DSPE-PEG-CPP）的合成  25-32
  前言  25
  材料与方法  25-28
  结果  28-29
  附图  29-30
  附表  30-31
  讨论  31
  小结  31
  参考文献  31-32
第三部分荷正电氨基酸修饰的基因递送纳米脂质载体构建和表征  32-48
  前言  32
  材料与方法  32-36
  结果  36-37
  附图  37-44
  附表  44-46
  讨论  46-47
  小结  47
  参考文献  47-48
第四部分细胞摄取效率:流式分析  48-56
  前言  48
  材料与方法  48-51
  结果  51-53
  附图  53-54
  附表  54-55
  讨论  55
  小结  55
  参考文献  55-56
结论  56-57
综述一种应用于肿瘤影像和治疗的可活化的细胞穿膜肽  57-75
  参考文献  69-75
致谢  75-76
个人简历  76

寡聚荷正电氨基酸修饰的基因递送纳米脂质载体的构建和初步评价

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