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毛细管电泳在生物样品分离分析中的应用研究

作　者: 应素燕
导　师: 王卫平
学　校: 浙江师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 毛细管电泳 类固醇激素 量子点 荧光探针
分类号: O658.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


毛细管电泳(CE)作为一种较新的微分离技术,具有快速简便、分离效率高、试剂消耗量少和灵敏度高等特点,广泛用于医学、环境和食品等复杂样品的分离分析。激光诱导荧光检测(LIF)是毛细管电泳最灵敏的检测方法之一,非常适合于复杂样品中的痕量组分分析。目前,CE-LIF常用于本身具有荧光性能或易被荧光试剂标记和染色的物质测定,但传统的荧光探针种类少,标记时间长。量子点作为一种新型的荧光探针,具有独特的光化学特性,如宽的激发光谱、窄的发射谱带、不易漂白和极好的光稳定性等,在生命分析化学、生物化学、分子生物学等领域显示出广阔的应用前景。生物样品具有样品量少、待测组分含量低、基质复杂等特点,实现生物样品中痕量组分的快速、灵敏检测,是分析工作者面临的巨大挑战。因此,开展生物样品中痕量组分分析方面的应用研究,建立复杂基质中目标分子的灵敏检测方法,具有重要的意义。该论文在综述前人工作的基础上,主要开展了以下研究工作：(1)建立了一种同时分离测定鱼血液中皮质醇、雌二醇及睾酮含量的胶束电动色谱法。研究了缓冲溶液浓度、添加剂含量、pH、分离电压及温度对分离的影响,得到了最佳分离条件。即运行缓冲溶液为12mmol/L硼砂+60mmol/L SDS+6mmol/L β-CD+8%(v/v)乙腈,pH9.5,检测波长225nm,分离电压25kV,分离温度25℃的条件下,采用毛细管短端进样(毛细管有效长度10cm),反向分离的模式,三种类固醇激素在4min内达到基线分离。且分析物在1.0～100.0μg/mL范围内呈良好的线性关系(相关系数>0.9932)。该法用于鱼血液中类固醇激素的检测,回收率为84.60～113.30%,满足生物样品检测要求。(2)以谷胱甘肽(GSH)为稳定剂合成了水溶性CdTe QDs,建立了一种量子点-溶菌酶共轭物分离分析的毛细管电泳新方法。以EDC(碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)为连接剂,将QDs与溶菌酶进行生物偶联,探讨了偶联剂用量、缓冲溶液类型及pH对偶联效果的影响,得到了最佳偶联条件：50mmol/L KH2PO4-Na2HPO4, pH7.4,20μL2.8×10-3mol/L CdTe,30μL25mg/mL EDC,30μL1.5mg/mL NHS,40μL1mg/mL溶菌酶。在最佳毛细管电泳分离条件(即10mmol/L硼砂,pH9.25,分离电压20kV,温度25℃)下,GSH-CdTe QDs及其溶菌酶共轭物能有效分离。该法可用于生物样品中痕量溶菌酶的标记检测。(3)利用合成QDs的优异荧光性能,以GSH-CdTe QDs作为荧光探针,建立了快速、灵敏测定人血清中二羟丙茶碱(DPP)含量的荧光分析法。考察了GSH-CdTe QDs在不同类型缓冲溶液及不同温度下的荧光强度,探讨了缓冲溶液pH,反应时间,加入次序,干扰离子等因素对GSH-CdTe QDs-DPP体系荧光强度的影响,得到最佳实验条件,即50mmol/L KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液,pH8.4,2℃下反应8分钟。在最佳实验条件下,固定QDs浓度为2.8×10-6mol/L, DPP在1.67×10-6～1.33×10-5mol/L范围内时,F0/F与DPP浓度呈良好线性关系(相关系数为0.9970),检出限2.24×10-7mol/L,相对标准偏差为3.05%(n=3)。将该法成功用于人血清中DPP的测定,回收率为87.41～117.94%,结果满意。此外,初步探讨了DPP的加入引起GSH-CdTe QDs荧光猝灭的反应机理。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
1 绪论  12-30
  1.1 毛细管电泳概述  12-19
    1.1.1 毛细管电泳的基本装置  12-13
    1.1.2 毛细管电泳的特点  13-14
    1.1.3 CE基本分离模式和原理  14-17
      1.1.3.1 毛细管区带电泳(CZE)  14-15
      1.1.3.2 胶束电动毛细管色谱(MECC)  15-16
      1.1.3.3 毛细管凝胶电泳(CGE)  16
      1.1.3.4 毛细管等电聚焦(CIEF)  16-17
      1.1.3.5 毛细管等速电泳(CITP)  17
    1.1.4 毛细管电泳检测器  17-19
      1.1.4.1 紫外-可见吸收检测  18
      1.1.4.2 激光诱导荧光检测  18
      1.1.4.3 电化学检测  18-19
      1.1.4.4 质谱检测  19
      1.1.4.5 化学发光检测器  19
  1.2 毛细管电泳的应用  19-21
    1.2.1 毛细管电泳在量子点分析中的应用  19-20
    1.2.2 毛细管电泳在生物样品分析中的应用  20-21
    1.2.3 毛细管电泳在农药分析中的应用  21
  1.3 量子点概述  21-24
    1.3.1 量子点的特点  22-23
    1.3.2 量子点的表征  23-24
      1.3.2.1 透射电子显微镜法  23
      1.3.2.2 红外吸收光谱法  23
      1.3.2.3 紫外可见吸收光谱法  23-24
      1.3.2.4 荧光光谱法  24
  1.4 量子点的应用  24-29
    1.4.1 无机离子检测  24-25
    1.4.2 药物检测  25-26
    1.4.3 蛋白质、核酸等生物大分子的标记  26-27
    1.4.4 生物组织和细胞的标记  27-28
    1.4.5 用于活体成像  28-29
  1.5 课题的提出  29-30
2 胶束电动色谱法快速测定鱼血液中的类固醇激素  30-40
  2.1 引言  30-31
  2.2 实验部分  31-32
    2.2.1 仪器和试剂  31-32
    2.2.2 样品制备  32
  2.3 结果与讨论  32-39
    2.3.1 缓冲溶液浓度的选择  32-33
    2.3.2 添加剂的选择  33-35
      2.3.2.1 β-CD对分离的影响  33
      2.3.2.2 表面活性剂(SDS)浓度对分离的影响  33-34
      2.3.2.3 乙腈(ACN)含量对分离的影响  34-35
    2.3.3 缓冲溶液pH对分离的影响  35-36
    2.3.4 分离电压和温度的影响  36
    2.3.5 标准曲线的建立  36-37
    2.3.6 样品测定  37-39
  2.4 结论  39-40
3 GSH-CdTe量子点与溶菌酶的偶联及其毛细管电泳分离分析研究  40-52
  3.1 引言  40-41
  3.2 实验部分  41-42
    3.2.1 仪器和试剂  41
    3.2.2 GSH-CdTe量子点的制备和提纯  41-42
    3.2.3 量子点溶菌酶共轭物的制备  42
    3.2.4 毛细管电泳仪操作  42
  3.3 结果与讨论  42-51
    3.3.1 量子点表征  42-45
      3.3.1.1 量子点的紫外荧光图谱  42-44
      3.3.1.2 量子点的红外吸收图谱  44
      3.3.1.3 量子点的透射电子显微镜图谱  44-45
    3.3.2 量子点标记条件的选择  45-48
      3.3.2.1 EDC溶液浓度  45-46
      3.3.2.2 NHS溶液浓度  46-47
      3.3.2.3 缓冲溶液类型  47
      3.3.2.4 缓冲溶液pH  47-48
    3.3.3 分离条件的选择  48-51
      3.3.3.1 缓冲溶液类型  48-49
      3.3.3.2 缓冲溶液浓度  49
      3.3.3.3 缓冲溶液pH  49-50
      3.3.3.4 分离电压和分离温度  50-51
  3.4 结论  51-52
4 CdTe量子点荧光猝灭法测定人血清中的二羟丙茶碱  52-62
  4.1 引言  52-53
  4.2 实验部分  53-54
    4.2.1 仪器与试剂  53
    4.2.2 GSH-CdTe量子点的制备和提纯  53
    4.2.3 二羟丙茶碱含量的测定  53-54
    4.2.4 样品制备  54
  4.3 结果与讨论  54-61
    4.3.1 二羟丙茶碱检测条件的优化  54-57
      4.3.1.1 缓冲溶液的影响  54-55
      4.3.1.2 温度的影响  55
      4.3.1.3 pH值的影响  55-56
      4.3.1.4 反应时间的影响  56-57
      4.3.1.5 试剂加入顺序的影响  57
    4.3.2 标准曲线、检出限和精密度  57-58
    4.3.3 干扰物质对反应体系的影响  58
    4.3.4 机理初探  58-60
    4.3.5 分析应用  60-61
  4.4 结论  61-62
5 结论与展望  62-64
  5.1 结论  62-63
  5.2 展望  63-64
参考文献  64-75
致谢  75-76
攻读硕士学位期间取得的研究成果  76-77

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 元素及化合物的分离方法 > 其他
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