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脱乙酰葡甘聚糖自卷及簇集中的疏水驱动及用于DNA电泳分离的基础研究

作　者: 朱黎萍
导　师: 李斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 脱乙酰魔芋葡甘聚糖疏水相互作用氢键作用簇集自卷曲荧光探针分析凝胶电泳基质
分类号: O631.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

中性多糖溶胶-凝胶体系中，除氢键作用外，评估其它次级相互作用的角色和贡献，是糖化学研究必须回答的基本科学问题。脱乙酰魔芋葡甘聚糖（DeacetylatedKonjac Glucomannan，d-KGM）在自卷、簇集及溶胶-凝胶相转变中的驱动力及维系力的本质，至今仍是魔芋科学中悬而未决的难题。为价格逐年趋高的魔芋找到针对其优势的高值利用途径，亦是产业升级的必然要求。本研究利用采用粘度法、TPA分析初步探讨从极稀至浓溶液的浓度范围内，d-KGM发生自卷、簇集及凝胶中疏水作用存在的可能性；并利用光谱探针刚果红的荧光光谱、CD、UV-Vis等对其进一步讨论。研究着重利用芘荧光探针技术，结合AFM在纳米尺度上的图像分析，对疏水相互作用存在性进行了确证和粗略度量。最后尝试将d-KGM用于生物分离的凝胶电泳基质组成物，以探索疏水作用对生物分离的可能影响，亦为发展一种低成本、低电内渗、高效率的新型凝胶基质奠定基础。主要研究结果如下：1、NaCl、CaCl₂、Na₂SO₄、NaNO₃溶液浓度增加，d-KGM分子尺寸的减小，减小幅度Cl^->SO₄^2->NO₃^-、Ca²⁺>Na⁺;低浓度的尿素因可破坏少量氢键而特性粘度略增，但高浓度时反而迅速降低，表明自卷并非仅为氢键作用加强所致;极稀浓度的SDS使d-KGM表观分子尺寸显著增加，提示d-KGM自卷体中可能存在疏水微区并与SDS的疏水端发生共簇集。2、尿素因氢键开裂作用使凝胶体的硬度急剧下降，而凝胶体的弹性和内聚性几无变化，表明维系凝胶整体网络结构（硬结构）的，还有另一种较强作用力；添加低于0．08 mol／L SDS的d-KGM凝胶，其硬度、弹性、内聚性、回复力均有所上升，提示SDS可能参与硬结构中疏水微区的形成，加强了疏水作用。温度提高可显著提高凝胶硬度、内聚性等，并在约65℃达到高点，证实维系凝胶的主要作用力肯定不是氢键作用，其表现类似于蛋白质的疏水作用的理论。3、KGM与d-KGM的动态接触浓度（Cs）分别为0．55gm和0．65g／L，临界接触浓度（Ce）分别为5．60g／L和4．50g／L。CD和荧光光谱分析表明脱乙酰导致KGM分子非对称立体构象的加强和分子结构从无序到部分有序的显著构象转变；UV-Vis表明d-KGM的有序结构与螺旋结构显著不同，再次提示疏水作用存在的可能性。4、添加了芘探针的d-KGM极稀及亚浓溶液中，I₁/I₃随d-KGM浓度增加而下降，确证了疏水相互作用的存在，但由于d-KGM缺少疏水基团，疏水相互作用较弱，I₁／I₃降幅较小。Na₂SO₄可被认为是d-KGM的解簇剂，NaCl和NaNO₃则可认为是促簇剂；浓度大于1．00 mol／L的尿素，减弱了d-KGM分子间的疏水相互作用，SDS与d-KGM分子间存在着较强共簇集作用，促进d-KGM疏水微区更多生成。5、AFM图像表明，完全脱乙酰后KGM强烈的自卷曲，形成了稳定的圆锥状结构；芘探针存在于圆锥状d-KGM的顶部，分子间疏水作用促进了芘探针的增溶；添加尿素后，d-KGM分子无规则堆积但仍有相当部分维持了其球状构象，表明低浓度的尿素并不影响疏水相互作用;SDS则可与d-KGM形成了规律排列的复合体，聚集体仍是由球状分子，但尺寸更大，高度4-5nm，估计为SDS与d-KGM疏水缔合的体现。6、d-KGM的加入使AG凝胶的电内渗值明显降低，添加0．75％的d-KGM时已经近似为零，凝胶电泳后均一性亦较纯AG凝胶亦有极大改善；不同分子量DNA的扩散系数因d-KGM的加入，混合凝胶扩散系数增幅变小，但混合凝胶的扩散系数与AG扩散系数表现为不同的规律：添加d-KGM后凝胶基质迁移率斜率大大上升，DNA电泳较短时间即能获得高分辨率清晰图像，同时分辨率更高，但分辨率的变化也与d-KGM量的关系不显著，说明DNA在d-KGM凝胶中分离机制与AG不同，因疏水相互作用表现出一定的特异性。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章前言  13-27
  1 魔芋葡甘聚糖研究进展  13-17
    1.1 魔芋葡甘聚糖中的乙酰基  13-15
    1.2 脱乙酰葡甘聚糖凝胶化及其机理  15-17
  2 多糖疏水相互作用研究现状与方法  17-24
    2.1 疏水相互作用的本质  18
    2.2 疏水相互作用导致的簇集和自卷曲现象  18-19
    2.3 多糖疏水作用研究进展  19-23
      2.3.1 可德胶凝胶机理研究进展  20-21
      2.3.2 甲基纤维素(MC)凝胶机理研究进展  21-22
      2.3.3 壳聚糖水凝胶疏水作用研究进展  22-23
    2.4 多糖疏水作用研究方法  23-24
  3 多糖凝胶用于电泳分离材料  24-25
  4 本课题研究目的、意义及创新点  25-27
    4.1 本课题研究目的  25
    4.2 意义及创新点  25-27
第二章几种小分子对d-KGM溶液及凝胶行为的影响  27-49
  1 前言  27-28
  2 材料与方法  28-30
    2.1 材料  28-29
      2.1.1 实验原料  28
      2.1.2 主要仪器  28-29
    2.2 实验方法  29-30
      2.2.1 KGM样品纯化  29
      2.2.2 d-KGM溶胶的制备  29-30
      2.2.3 特性粘度的测定  30
      2.2.4 凝胶质构性能测试  30
  3 结果与分析  30-46
    3.1 稀溶液中d-KGM自卷曲的特性粘度分析  30-36
      3.1.1 电解质对特性粘度的影响  31-34
      3.1.2 尿素对d-KGM特性粘度的影响  34-35
      3.1.3 SDS对d-KGM特性粘度的影响  35-36
    3.2 浓溶液中d-KGM簇集体的质构分析  36-46
      3.2.1 电解质对d-KGM凝胶质构的影响  37-40
      3.2.2 尿素对d-KGM凝胶质构特性的影响  40-41
      3.2.3 SDS对d-KGM凝胶质构特性的影响  41-42
      3.2.4 温度对d-KGM凝胶质构特性的影响  42-46
        3.2.4.1 温度对添加电解质的d-KGM凝胶质构特性的影响  42-44
        3.2.4.2 温度对添加尿素的d-KGM凝胶质构特性的影响  44-45
        3.2.4.3 温度对添加SDS的d-KGM凝胶质构特性的影响  45-46
  4 讨论  46-49
第三章 d-KGM/刚果红水溶液的光谱学研究  49-63
  1 前言  49-50
  2 材料与方法  50-52
    2.1 材料  50-51
      2.1.1 实验原料  50
      2.1.2 主要仪器  50-51
    2.2 实验方法  51-52
      2.2.1 KGM样品纯化  51
      2.2.2 脱乙酰魔芋(d-KGM)溶胶的制备  51
      2.2.3 动态接触浓度的测定  51
      2.2.4 临界交叠浓度的测定  51
      2.2.5 刚果红/d-KGM复合物荧光光谱测定  51-52
      2.2.6 圆二色谱测定  52
      2.2.7 紫外可见吸收光谱分析  52
  3 结果与讨论  52-60
    3.1 KGM与d-KGM的动态接触浓度(Cs)  52-54
    3.2 KGM与d-KGM的临界交叠浓度(Ce)  54-55
    3.3 d-KGM/CR混合物荧光光谱分析  55-57
    3.4 圆二色谱分析  57-59
    3.5 d-KGM/CR混合物紫外可见光谱分析  59-60
  4 讨论  60-63
第四章 d-KGM溶液中疏水相互作用研究  63-89
  1 前言  63-64
  2 材料与方法  64-66
    2.1 材料  64-65
      2.1.1 实验原料  64-65
      2.1.2 主要仪器  65
    2.2 实验方法  65-66
      2.2.1 KGM样品纯化  65
      2.2.2 脱乙酰魔芋(d-KGM)溶胶的制备  65
      2.2.3 荧光光谱测定  65-66
      2.2.4 原子力显微镜(AFM)分析  66
  3 结果与讨论  66-86
    3.1 d-KGM芘荧光光谱测定  66-78
      3.1.1 d-KGM浓度对芘荧光光谱的影响  67-70
      3.1.2 电解质对d-KGM芘荧光光谱影响  70-74
      3.1.3 尿素对d-KGM芘荧光光谱影响  74-76
      3.1.4 SDS对d-KGM芘荧光光谱影响  76-78
    3.2 d-KGM的原子力显微镜图像分析  78-86
      3.2.1 d-KGM的原子力图像分析  78-79
      3.2.2 添加芘探针的d-KGM的AFM图像分析  79-83
      3.2.3 添加芘探针的d-KGM/尿素混合物原子力图像分析  83-86
      3.2.4 添加芘探针的d-KGM-SDS复合物原子力图像分析  86
  4 讨论  86-89
第五章 d-KGM用于凝胶电泳分离DNA的基础研究  89-107
  1 前言  89
  2 材料与方法  89-93
    2.1 材料  89-90
      2.1.1 实验原料  89-90
      2.1.2 主要仪器  90
    2.2 实验方法  90-93
      2.2.1 KGM样品纯化  90
      2.2.2 脱乙酰魔芋(d-KGM)溶胶的制备  90-91
      2.2.3 混合凝胶电泳基质的制备  91
      2.2.4 混合凝胶电泳基质电内渗测定  91
      2.2.5 混合凝胶电泳基质质构测定  91-92
      2.2.6 DNA在混合凝胶中扩散系数测定  92
      2.2.7 DNA在混合凝胶中电动力学行为  92-93
  3 结果与讨论  93-105
    3.1 混合凝胶电泳基质的电内渗  93-94
    3.2 混合凝胶电泳基质质构  94-95
    3.3 DNA在混合凝胶电泳基质中的电泳结果  95-96
    3.4 DNA在混合凝胶中的扩散  96-101
      3.4.1 DNA在不同共混凝胶电泳基质中的扩散  97-100
      3.4.2 不同电压下DNA的扩散  100-101
    3.5 DNA在混合凝胶中电动力学行为  101-105
  4 讨论  105-107
第六章结论与展望  107-109
  1 结论  107-108
  2 展望  108-109
参考文献  109-121
致谢  121

脱乙酰葡甘聚糖自卷及簇集中的疏水驱动及用于DNA电泳分离的基础研究

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