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芜菁MYB75和TT8在花青素合成途径中相互作用的分析

作　者: 王冠杰
导　师: 李玉花
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: MYB75和TT8 亚细胞定位 酵母双杂交 瞬时表达 转基因番茄和烟草
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


转录因子在植物整个生长发育过程中,起着重要的作用。其通过各自不同的功能域与DNA以及其他蛋白发生相互作用,从而激活或抑制相关基因的表达。MYB类转录因子(?)nbHLH类转录因子为植物中两类重要的家族蛋白,在植物花青素的合成、抵抗生物或非生物的胁迫、调控相关基因的表达等方面起着重要的作用。本文以光敏感型津田芜菁为试验材料,对已克隆的BrMYB75(?)BrTT8转录因子基因,进行表达水平的检测、亚细胞定位检测、瞬时表达调控检测、酵母双杂交检测等。分析芜菁花青素合成过程中以及光诱导过程BrMYB75和BrTT8蛋白对BrCHSl表达的调控作用,同时构建BrMYB75和BrTT8的过量表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化,分子检测阳性转基因的烟草和番茄植株,分析BrMYB75和BrTT8对花青素合成的调控,为进一步研究MYB类和bHLH类转录因子功能提供了基础。主要研究结果如下：1、MYB75与TT8转录因子与植物花青素的合成相关,且MYB75与TT8的组织特异性和光诱导特异性表达一致。2、成功构建含有GFP荧光蛋白的重组表达载体GFP-BrMYB75和GFP-BrTT8,洋葱表皮瞬时表达结果表明BrMYB75蛋白和BrTT8蛋白均定位于细胞核。3、成功构建表达载体Y2HBD-BrMYB75和Y2HAD-BrTT8,转化酵母感受态,酵母双杂交结果表明只有实验组的酵母菌斑呈现蓝色,其他菌斑均呈现白色。说明BrMYB75(?)BrTT8蛋白具有相互作用。4、成功构建OE-BrMYB75和OE-BrTT8过量表达载体并转化农杆菌,将其与含有BrCHS启动子的荧光素酶载体的农杆菌菌种混合,共同瞬时转染烟草叶片。结果表明MYB75和TT8协同调控CHS启动子的活性,而单独的MYB75或TT8对CHS启动子的活性影响较小,说明MYB75(?)TT8对CHS基因的表达有调控作用。5、利用Gateway的方法成功构建无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-BrMYB75(?)pCAMBIA1301-PMI-BrTT8,通过农杆菌介导的遗传转化番茄和烟草。用含有甘露糖的选择培养基筛选不定芽,筛选阳性植株。提取植株DNA进行PCR检测,结果表明初步获得了转基因植株。在植物光诱导花青素合成的途径中,MYB75和TT8转录因子对花青素合成结构基因CHS的调控作用通过本论文的研究得到了初步的证明,但MYB75和TT8在植物花青素合成途径中的功能还需要进行更加深入的研究。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-21
  1.1 植物转录因子的相关研究  10-12
    1.1.1 植物转录因子的功能结构域  10-11
    1.1.2 植物转录因子的活性  11
    1.1.3 植物转录因子的功能多样性  11-12
  1.2 植物MYB类转录因子研究进展  12-15
    1.2.1 植物中MYB类转录因子的发现与进化  12
    1.2.2 植物中MYB类转录因子的结构和分类  12-14
    1.2.3 植物中MYB类转录因子的生物学功能  14-15
  1.3 植物bHLH类转录因子研究进展  15-17
    1.3.1 植物中bHLH类转录因子的结构特征  16
    1.3.2 植物中bHLH类转录因子的分类  16
    1.3.3 植物中bHLH类转录因子的生物学功能  16-17
  1.4 植物MYB类和bHLH类转录因子相互作用的研究进展  17-20
    1.4.1 植物MYB-bHLH复合体的起源与进化  17-18
    1.4.2 植物MYB和bHLH类转录因子相互作用的机理  18
    1.4.3 植物MYB-bHLH复合体的功能多样性  18-20
  1.5 研究目的及意义  20-21
2 BrMYB75和BrTT8转录因子在花青素合成过程中的组织特异性和光诱导表达  21-24
  2.1 材料与方法  21-22
    2.1.1 试验材料与试剂  21
    2.1.2 津田芜菁总RNA的提取  21
    2.1.3 反转录  21-22
    2.1.4 Real-Time PCR反应  22
  2.2 结果与分析  22-23
  2.3 讨论  23
  2.4 本章小结  23-24
3 BrMYB75和BrTT8转录因子的亚细胞定位  24-32
  3.1 材料与方法  24-28
    3.1.1 试验材料与试剂  24
    3.1.2 GFP融合表达载体的构建  24-28
    3.1.3 真空渗透法转化洋葱表皮细胞  28
  3.2 结果与分析  28-31
    3.2.1 融合表达载体的构建  28-30
    3.2.2 重组质粒在洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测  30-31
  3.3 讨论  31
  3.4 本章小结  31-32
4 BrMYB75和BrTT8蛋白的相互作用的检测  32-40
  4.1 材料与方法  32-36
    4.1.1 试验材料  32
    4.1.2 引物设计与合成  32
    4.1.3 PAD-TT8和PAD-MYB75载体的构建  32-35
    4.1.4 酵母双杂交  35-36
  4.2 结果与分析  36-39
    4.2.1 PAD-TT8和PAD-MYB75载体的构建及鉴定  36-38
    4.2.2 Y2HBD-MYB75和Y2HAD-TT8表达载体间蛋白的相互作用  38-39
  4.3 讨论  39
  4.4 本章小结  39-40
5 BrMYB75和BrTT8转录因子对关键CHS启动子的调控--瞬时表达  40-44
  5.1 试验材料与试剂  40
  5.2 试验方法  40-42
    5.2.1 农杆菌菌液对烟草叶片的浸染  40-41
    5.2.2 对瞬时表达结果的检测  41
    5.2.3 对瞬时表达后叶片中花青素含量的测定  41-42
  5.3 试验结果  42-43
    5.3.1 农杆菌菌液对烟草叶片的浸染  42
    5.3.2 检测双荧光素酶来分析MYB75和TT8对关键CHS启动子的调控  42
    5.3.3 检测花青素来分析MYB75和TT8对关键CHS启动子的调控  42-43
  5.4 讨论  43
  5.5 本章小结  43-44
6 津田芜菁pCAMBIA1301-PMI-MYB75及津田芜菁pCAMBIA1301-PMI-TT8表达载体的构建及番茄的遗传转化  44-66
  6.1 试验材料与试剂  44-45
    6.1.1 供试菌株、抗生素及质粒  44
    6.1.2 酶和试剂  44-45
    6.1.3 培养基  45
  6.2 试验方法  45-52
    6.2.1 pCAMBIA1301-PMI-BrMYB75、pCAMBIA1301-PMI-BrTT8植物表达载体的构建  45-48
    6.2.2 pCAMBIA1301-PMI-BrMYB75、pCAMBIA1301-PMI-BrTT8植物表达载体转化农杆菌  48-49
    6.2.3 农杆菌介导的番茄遗传转化  49-50
    6.2.4 植物基因组DNA的提取  50
    6.2.5 转基因植株的PCR检测  50-52
  6.3 结果与分析  52-64
    6.3.1 pCAMBIA1301-PMI-BrMYB75、pCAMBIA1301-PMI-BrTT8植物表达载体的构建  52-55
    6.3.2 转化农杆菌菌株的鉴定  55-56
    6.3.3 农杆菌介导的番茄遗传转化  56-59
    6.3.4 再生植株PCR检测  59-64
  6.4 讨论  64-65
  6.5 本章小结  65-66
结论  66-67
参考文献  67-77
攻读学位期间发表的学术论文  77-78
致谢  78-79

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生理学
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