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乙烯调控拟南芥HY5蛋白稳定性和幼苗下胚轴生长

作　者: 于延文
导　师: 黄荣峰
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 下胚轴乙烯 HY5 拟南芥蛋白降解
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植物的生长离不开光，除了作为光合作用的能源物质，光还充当一种信号分子调控植物的生长发育。光照条件下拟南芥幼苗表现为下胚轴变短，子叶伸展、变绿的光形态建成表型；而在黑暗条件下，拟南芥幼苗则表现出下胚轴伸长，顶端弯曲，子叶窄小、黄化的暗形态建成表型。植物在感受外界环境变化的同时还会启动内源植物激素的调控功能，如植物激素乙烯可以使植物产生典型的“三重反应”，在拟南芥中表现为黄化幼苗的下胚轴变短、变粗，根变短，顶端弯钩加剧；与黑暗条件下相反，乙烯在光下可以促进拟南芥下胚轴的生长。最新研究表明，乙烯通过ETHYLENE INSENSITIVE3(EIN3)激活了两条功能相反的通路，一条由PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR3(PIF3)介导促进下胚轴伸长，主要在光下起作用，另一条通过ETHYLENE RESPONSE FACTOR1(ERF1)抑制下胚轴伸长，主要在暗下起作用。在本研究中，我们进一步探讨了乙烯促进光下下胚轴生长的过程，在蛋白水平上发现了乙烯介导光形态建成因子调控拟南芥下胚轴生长的新途径。通过分析表型，并结合生化、遗传实验，我们发现光形态建成因子LONG HYPOCOTYL(HY5)是乙烯调控光下拟南芥下胚轴生长的新组分。首先，我们分析了乙烯信号转导相关的突变体和光形态建成负调控因子hy5突变体的表型，发现乙烯对于下胚轴生长的促进作用在hy5突变体中被抑制，确定了HY5是参与乙烯调控光下拟南芥下胚轴生长的必须因子；eto2和35S::HY5的杂交材料表现出比eto2短的下胚轴，进一步证明eto2突变体中内源乙烯引起的下胚轴伸长是由HY5介导的。Western检测植物体内HY5的蛋白含量发现：乙烯合成前体ACC处理可以促进HY5蛋白的降解，并且这种作用随ACC处理的浓度增大或时间延长而加剧，证明乙烯对HY5蛋白的降解作用具有剂量效应和积累效应；ACC对HY5的降解作用可以被蛋白酶体抑制剂MG132抑制，表明这一过程是由蛋白酶体途径介导的。生化试验还发现乙烯过量生成或信号激活突变体中HY5蛋白含量降低，而乙烯信号阻断突变体中HY5蛋白含量同野生型变化不大，但ACC对于HY5蛋白降解的促进作用却被抑制，这些结果都表明乙烯通过其信号途径在蛋白水平影响HY5的积累。分析生化和遗传的实验结果还发现，HY5在乙烯调控下胚轴生长的途径中位于EIN3的下游。综上所述，乙烯通过蛋白酶体途径调控HY5的积累，HY5蛋白的变化进一步又影响了拟南芥下胚轴的生长，这一发现也初步揭示了拟南芥通过HY5整合外源光信号与内源乙烯信号的新途径。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-20
  1.1 植物激素乙烯的研究进展  12-16
    1.1.1 乙烯简介  12
    1.1.2 乙烯的生物合成及调控  12-14
    1.1.3 乙烯的信号转导  14-16
    1.1.4 乙烯与下胚轴的生长  16
  1.2 HY5 的研究进展  16-19
    1.2.1 拟南芥 HY5 的结构  16-17
    1.2.2 HY5 蛋白的降解调控  17
    1.2.3 HY5 的功能  17-19
  1.3 研究目的与意义  19-20
第二章材料与方法  20-30
  2.1 实验材料  20-21
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 试剂  20
    2.1.3 质粒及菌株  20-21
    2.1.4 引物信息  21
  2.2 实验方法  21-30
    2.2.1 实验所用培养基的配置  21
    2.2.2 拟南芥的种植  21-22
    2.2.3 拟南芥下胚轴的测量和数据统计  22
    2.2.4 拟南芥基因组 DNA 的提取  22
    2.2.5 拟南芥总 RNA 的提取  22
    2.2.6 反转录合成 cDNA 第一条链  22-23
    2.2.7 基因克隆  23-25
    2.2.8 植物过表达载体的构建  25-26
    2.2.9 农杆菌电击感受态的制备及转化  26
    2.2.10 拟南芥的转化及筛选  26-27
    2.2.11 突变体的鉴定  27
    2.2.12 荧光定量 PCR (Real-time PCR)反应体系及程序  27-28
    2.2.13 拟南芥总蛋白的提取  28
    2.2.14 SDS-PAGE 蛋白电泳  28
    2.2.15 蛋白免疫印迹检测（Western Blot）  28-30
第三章结果与分析  30-39
  3.1 乙烯促进光下拟南芥下胚轴的生长  30-31
  3.2 乙烯通过 HY5 调控拟南芥下胚轴的生长  31-35
    3.2.1 光下 hy5 突变体对乙烯不敏感  31-32
    3.2.2 eto2×35S::HY5 杂交材料的构建和表型分析  32-35
  3.3 乙烯影响 HY5 蛋白的稳定性  35-37
    3.3.1 乙烯相关突变体中 HY5 基因的表达量  35
    3.3.2 ACC 处理后 HY5 的蛋白水平  35-36
    3.3.3 乙烯相关突变体中 HY5 的蛋白含量  36
    3.3.4 不同浓度和时间的 ACC 处理对 HY5 蛋白水平的影响  36-37
    3.3.5 ACC 通过蛋白酶体途径促进 HY5 的降解  37
  3.4 HY5 与乙烯信号元件的遗传关系  37-39
    3.4.1 杂交材料的构建与筛选  37
    3.4.2 杂交材料的表型观察  37-39
第四章讨论  39-41
第五章全文结论  41-42
  5.1 结论  41
  5.2 创新点  41-42
参考文献  42-48
致谢  48-49
作者简介  49

乙烯调控拟南芥HY5蛋白稳定性和幼苗下胚轴生长

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