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自噬现象与乙肝病毒复制的关系

作　者: 傅麒宁
导　师: 毛一雷
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 乙肝病毒复制自噬
分类号: R373.21
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

[研究目的]通过研究自噬现象在乙肝病毒复制中所扮演的角色,寻找降低乙肝病毒复制的新途径,并通过对其机制的研究,探讨该现象对于宿主细胞生存的影响及其致癌性的可能机理。[研究方法]1.用HepG2.2.15细胞系和pUC1857-1HBV1.2质粒转染的HepG2细胞系构建出有HBV复制的细胞系；2.采用3-甲基腺嘌呤和无胎牛血清培养基作为自噬现象的干预手段,使用HepG2细胞系和pUC18质粒转染的HepG2细胞系作为对照,通过测量上清中HBV拷贝数评估HBV复制情况,并对细胞裂解液采用蛋白免疫印迹法(Western Blotting)对自噬水平进行分析；3.使用GFP-LC3质粒转染的细胞及HBcAg免疫荧光抗体,通过荧光显微镜对HBV复制和自噬的水平进行评估：4.采用WST-1试剂及酶标仪测定,对细胞增殖状态进行评估。[研究结果]1. HepG2.2.15细胞系和pUC1857-1HBV1.2质粒转染的HepG2细胞均有HBV产生和分泌。2.有HBV复制产生的细胞系——-HepG2.2.15细胞系或pUC1857-1HBV1.2质粒转染的HepG2细胞中,P62蛋白水平的下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,说明HBV复制有诱导自噬的作用。3.在HepG2.2.15细胞系中,使用1mM浓度的自噬抑制剂3-MA,可以减少上清液中HBV的拷贝数。但是对于10mM浓度的3-MA,以及不含FBS的乏营养培养基对上清中HBV拷贝数的影响尚缺乏具有显著性差异的结论。4.转染pEGFP-C1-LC3质粒HepG2细胞中,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中。而转染pEGFP-C1-LC3质粒的HepG2.2.15细胞可以看到多个明亮的绿色荧光斑点。并且LC3斑点数量与HBcAg荧光斑点数量有一定程度的相关性,但两者未表现出共定位。5.在无血清培养基的饥饿状态下,有HBV复制的细胞系增殖更快,加入10mM的3-MA则会抑制这种增殖。提示HBV所上调的自噬有利于细胞在极端情况下的生存。[结论]乙肝病毒可以提高其宿主细胞中自噬的水平,但自噬对于乙肝病毒的复制、产生的意义以及具体的机制还有待于进一步探索。同时乙肝病毒也许有利于宿主细胞在应激情境下生存状态,但这种影响还需进一步的试验验证。更深入的研究也许将为我们治疗乙肝病毒感染,阻止或减缓慢性乙肝病毒感染向肝硬化、肝癌进展提供新的思路。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
缩略词表  8-10
引言  10-16
材料与方法  16-27
实验结果  27-40
讨论  40-46
结论  46-47
综述  47-57
参考文献  57-63
在学期间发表论文及参与课题  63-64
致谢  64-67

自噬现象与乙肝病毒复制的关系

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