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口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究

作　者: 陈豪泰
导　师: 张永光
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒 基因组 遗传变异 病毒拯救 舌下免疫
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 4次
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内容摘要


首先，为明了口蹄疫病毒基因组的结构特征及其变异与结构、功能的关系以及系统发生关系，利用DNAstar和Clustalx程序进行了207个口蹄疫病毒基因组序列的同源性分析、多重排比，口蹄疫病毒基因组ORF大小有所差异，范围为6963-7120nt，编码2320-2339aa的多聚蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性，7个不同血清型间＞77.6%和＞78.3%，本研究发现了可能和生物学功能相关的新的保守和变异区域，研究口蹄疫病毒RNA的保守性、变异性及其遗传变异对理解FMDV的感染、宿主范围和传播有重要作用。其次，根据口蹄疫病毒基因组序列，利用引物软件设计了覆盖口蹄疫病毒基因组的重叠引物，感染细胞中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法分段分别扩增了基因片段，利用单一酶切位点，分别消化各扩增片段和载体，在体外分别进行构建。然后用人工合成基因法合成一段含有20个C碱基的基因片段，利用两端的限制性内切酶位点，将该基因片段连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定及全长cDNA测序，分别扩增出了各基因片段，全基因组序列测定结果也与原来的测序结果一致，证实成功构建了口蹄疫病毒基因组全长cDNA分子，并通过体外反转录的方法，拯救并获得口蹄疫基因工程病毒。再次，为了研究金四氧化三铁纳米粒子作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫灭活疫苗的黏膜免疫应答。通过舌下接种方式，将口蹄疫疫苗和纳米粒子共同免疫小鼠，用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位IgA滴度，检测小鼠淋巴细胞增殖反应水平，通过流式细胞仪检测T细胞内IFN-γ和IL-4的表达量。与单独接种疫苗相比，加入分子佐剂后，可以诱导更高水平的黏膜IgA的表达及分泌，极大的提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应以及淋巴细胞中IL-4的表达量。金四氧化三铁纳米粒子作为分子佐剂，通过舌下免疫后，可以有效增强机体对口蹄疫灭活疫苗的黏膜免疫应答，对于预防口蹄疫病毒的感染和清除体内病毒起到重要的作用。最后，为了探讨壳聚糖对口蹄疫病毒核酸疫苗免疫反应的影响。应用壳聚糖作为口蹄疫核酸疫苗递送载体，采用肌肉注射和舌下免疫Balb/c小鼠，并以肌注不同剂量核酸、灭活疫苗组和生理盐水组作为对照，分别检测不同疫苗免疫后的细胞和体液和局部黏膜免疫水平。肌注壳聚糖疫苗组和舌下壳聚糖疫苗组高的细胞和体液免疫反应，且产生与灭活疫苗相似的细胞免疫应答，RNA疫苗诱导体液免疫的能力更强，舌下壳聚糖疫苗组产生粘膜免疫。上述研究结果表明，壳聚糖具有一定的免疫佐剂效应，为获得更有效的口蹄疫RNA疫苗提供了新策略，但该疫苗的推广应用还有待于对影响疫苗免疫效果的各因素进行后续优化和研究。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
文缩略表  6-12
第一章 文献综述  12-28
  1.1 口蹄疫病毒及其流行病学  12-15
    1.1.1 O 型口蹄疫病毒  14
    1.1.2 A 型口蹄疫病毒  14
    1.1.3 亚洲 1 型口蹄疫病毒  14
    1.1.4 南非 1、2 和 3 型口蹄疫病毒  14
    1.1.5 C 型口蹄疫病毒  14-15
  1.2 口蹄疫准种研究进展  15-19
    1.2.1 错配倾向的复制和病毒准种  15-16
    1.2.2 错误灾变  16
    1.2.3 病毒准种、适合度和进化选择  16-17
    1.2.4 口蹄疫病毒准种特性  17-18
    1.2.5 口蹄疫准种株的量化  18
    1.2.6 口蹄疫准种的优势株与劣势株  18-19
  1.3 口蹄疫疫苗  19-24
    1.3.1 灭活疫苗  20
    1.3.2 紧急疫苗  20
    1.3.3 油佐剂疫苗  20-21
    1.3.4 氢氧化铝疫苗  21
    1.3.5 可饲疫苗  21
    1.3.6 抗原表位疫苗  21
    1.3.7 核酸疫苗  21-22
    1.3.8 合成肽疫苗  22
    1.3.9 病毒样颗粒疫苗  22-23
    1.3.10 病毒载体疫苗  23
    1.3.11 基因工程病毒灭活疫苗  23
    1.3.12 弱毒活疫苗  23-24
    1.3.13 疫苗佐剂与病毒抑制剂  24
  1.4 口蹄疫天然免疫  24-28
    1.4.1 巨噬细胞（Macrophages，MΦ)  24-25
    1.4.2 树突状细胞（Dendritic cells，DC)  25-26
    1.4.3 淋巴细胞（Lymphocytes）  26
    1.4.4 非免疫细胞（non-immunological cells）  26
    1.4.5 干扰素（I interferon type I）  26-27
    1.4.6 天然免疫反应（Innate immune response）  27-28
第二章 口蹄疫病毒基因组的遗传变异分析  28-37
  2.1 前言  28-29
  2.2 材料和方法  29-30
    2.2.1 口蹄疫基因组序列  29
    2.2.2 口蹄疫基因组同源性分析  29
    2.2.3 口蹄疫病毒基因组序列的多重排比和进化关系分析  29
    2.2.4 口蹄疫病毒基因组的非编码区二级结构预测  29-30
  2.3 结果  30-34
    2.3.1 口蹄疫病毒基因组结构与各组分的大小  30
    2.3.2 口蹄疫病毒基因组的变异性和保守性  30-33
    2.3.3 口蹄疫病毒基因组的进化关系  33-34
  2.4 讨论  34-36
  2.5 小结  36-37
第三章 O 型口蹄疫病毒基因组的遗传变异  37-46
  3.1 前言  37
  3.2 材料与方法  37-39
    3.2.1 酶及主要试剂  37-38
    3.2.2 溶液及其配制  38
    3.2.3 仪器  38
    3.2.4 病毒 RNA 的提取  38
    3.2.5 引物设计  38
    3.2.6 目的片段扩增  38
    3.2.7 产物的回收与纯化  38-39
    3.2.8 病毒基因组测序  39
    3.2.9 口蹄疫基因组序列  39
    3.2.10 口蹄疫基因组同源性分析  39
    3.2.11 口蹄疫病毒基因组序列的多重排比和进化关系分析  39
  3.3 结果  39-44
    3.3.1 O 型口蹄疫病毒基因组同源性分析  39-43
    3.3.2 口蹄疫病毒基因组的进化关系  43-44
  2.4 讨论  44-46
第四章 口蹄疫病毒全长构建和拯救  46-54
  4.1 前言  46-47
  4.2 材料与方法  47-49
    4.2.1 生物酶和试剂  47
    4.2.2 引物设计  47
    4.2.3 细胞和种毒  47-48
    4.2.4 体外转录 RNA 的制备  48
    4.2.5 转染 BHK-21 细胞  48
    4.2.6 电子显微镜观察  48
    4.2.7 PCR 法检测病毒基因组  48
    4.2.8 间接免疫荧光检测病毒  48-49
    4.2.9 病毒蚀斑实验  49
    4.2.10 乳鼠毒力实验  49
  4.3 结果  49-52
    4.3.1 体外转录结果  49-50
    4.3.2 细胞病变观察  50
    4.3.3 电镜结果  50
    4.3.4 PCR 鉴定结果  50-51
    4.3.5 免疫荧光检测结果  51
    4.3.6 蚀斑实验  51-52
    4.3.7 乳鼠毒力试验  52
  4.4 讨论  52-54
第五章 口蹄疫基因工程病毒灭活疫苗舌下免疫研究  54-63
  5.1 前言  54
  5.2 材料与方法  54-57
    5.2.1 病毒、细胞和实验动物  54
    5.2.2 主要试剂及配制  54
    5.2.3 病毒培养  54-55
    5.2.4 病毒的灭活  55
    5.2.5 病毒的纯化  55-56
    5.2.6 病毒 146S 含量测定  56
    5.2.7 动物免疫和 ELISA 检测  56
    5.2.8 病毒中和试验  56
    5.2.9 淋巴细胞转化试验  56-57
    5.2.10 肺脏和肠道洗液的收集  57
    5.2.11 肺脏和肠道中 IgA 检测  57
    5.2.12 统计学分析  57
  5.3 结果  57-61
    5.3.1 基因工程病毒灭活检测  57-58
    5.3.2 基因工程病毒抗体的测定  58-59
    5.3.3 口蹄疫基因工程病毒黏膜抗体测定  59-60
    5.3.4 淋巴细胞增殖检测  60
    5.3.5 细胞因子水平检测  60-61
    5.3.6 基因工程病毒灭活疫苗的动物攻毒实验  61
    5.3.7 乳鼠免疫保护实验  61
  5.4 讨论  61-62
  5.5 小结  62-63
第六章 口蹄疫病毒缺失毒株构建和拯救  63-70
  6.1 前言  63
  6.2 材料与方法  63-65
    6.2.1 菌株、试验动物及试剂  63
    6.2.2 溶液及其配制  63
    6.2.3 质粒构建和 RNA 体外转录  63-64
    6.2.4 转染和口蹄疫病毒 RNA 定量  64
    6.2.5 病毒增长曲线  64
    6.2.6 病毒中和试验  64-65
    6.2.7 统计学分析  65
  6.3 结果  65-68
  6.4 讨论  68-70
第七章 口蹄疫缺失病毒核酸疫苗舌下免疫研究  70-79
  7.1 前言  70-71
  7.2 材料与方法  71-73
    7.2.1 疫苗与动物  71
    7.2.2 主要试剂  71
    7.2.3 壳聚糖纳米粒制备  71
    7.2.4 动物和免疫  71
    7.2.5 病毒中和试验  71-72
    7.2.6 淋巴细胞转化试验  72
    7.2.7 ELISA 检测抗体水平  72-73
  7.3 结果  73-76
    7.3.1 IgG 水平检测  73
    7.3.2 IgA 水平检测  73-74
    7.3.3 淋巴细胞增值试验  74-75
    7.3.4 粘膜免疫水平检测  75
    7.3.5 细胞微量中和试验  75-76
    7.3.6 豚鼠免疫保护实验  76
    7.3.7 乳鼠免疫保护实验  76
  7.4 讨论  76-77
  7.5 小结  77-79
参考文献  79-104
致谢  104-105
作者简历  105-108

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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