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一种艾滋病病毒潜在抑制剂的功能研究

作　者: 潮礼君
导　师: 陈应华
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: HIV-1 gp41 POB1 膜融合抑制剂内吞
分类号: R373
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

人类免疫缺陷病毒（HIV-1）跨膜蛋白gp41在病毒侵染靶细胞的膜融合过程中发挥了关键作用，是膜融合抑制剂研究中的重要靶点。此外，gp41还能够通过与靶细胞内某些蛋白发生相互作用，调控细胞的某些生理功能。在前期的研究中，我们通过酵母双杂交技术从人骨髓cDNA文库中筛选到一个HIV-1gp41的潜在结合蛋白POB1。基于POB1具有抑制HIV-1病毒介导的膜融合活性，本论文将POB1作为潜在的病毒抑制剂进行了相关研究，实验证明POB1具有抑制病毒感染的能力。在酵母双杂交实验的基础上，我们采用多种生化技术手段验证了HIV-1gp41和POB1的结合能力。结果表明，POB1通过C端螺旋区（C60）与gp41相互作用，而gp41的六螺旋结构及其包含的N末端七重复序列（NHR）与POB1均有较强的结合能力。我们将C60作为潜在的膜融合抑制剂进行了一系列研究。C60不能抑制gp41融合活性六螺旋结构的形成，但是在合胞体实验和病毒感染实验中均显示出一定的抑制活性，对X4嗜性株HIV-1IIIB和R5嗜性株HIV-1Bal的半抑制浓度在微摩尔级。这些结果表明，C60的抑制机理可能与已知膜融合抑制剂的抑制机理不尽相同，这两者的异同有待进一步阐明。对C60抑制机理的深入研究，有助于我们进一步揭示病毒介导的膜融合过程的细节。我们对gp41与POB1相互作用的生理意义进行了进一步的研究。POB1蛋白在细胞内参与了EGF介导的内吞信号通路，目前已经报导存在POB1(1-521)和POB1(1-659)两种同源蛋白。我们克隆出了一个新的同源蛋白POB1(1-460)。实验结果表明gp41与POB1(1-460)在真核细胞内依然能够发生相互作用。HIV-1gp41的存在能够显著增强A431细胞和CHO细胞的内吞作用，而且增强的内吞作用能够促进不表达CD4受体的A431细胞对HIV-1假病毒颗粒的摄入，这可能导致HIV-1病毒感染的增强。一个可能的推测是gp41所起的作用与EGF介导的信号类似，能够作为一个骨架蛋白招募参与内吞过程的POB1、epsin等蛋白，持续激活内吞通路。以上推测还需要后续实验证实。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
主要符号对照表  8-9
第1章引言  9-35
  1.1 艾滋病的流行趋势和防治状况  9-12
  1.2 人类免疫缺陷病毒（HIV）  12-16
    1.2.1 HIV的发现历史及分类  12-13
    1.2.2 HIV-1病毒粒子结构  13-14
    1.2.3 HIV-1的生命周期与HIV-1感染  14-16
  1.3 艾滋病的预防与治疗  16-19
    1.3.1 艾滋病疫苗研发情况  16-17
    1.3.2 艾滋病临床药物治疗  17-19
  1.4 膜融合抑制剂  19-29
    1.4.1 HIV-1 gp41与病毒膜融合过程  20-23
    1.4.2 HIV-1膜融合抑制剂研究进展  23-28
    1.4.3 HIV-1对膜融合抑制剂的耐药性  28-29
  1.5 HIV-1 gp41与宿主细胞蛋白的相互作用及功能调控  29-33
  1.6 本论文的研究目的和内容  33-35
第2章 HIV-1 gp41 与 POB1 相互作用的性质研究  35-63
  2.1 本章引言  35-36
  2.2 实验材料和方法  36-48
    2.2.1 引物设计  36-38
    2.2.2 重组质粒构建  38-41
    2.2.3 酵母双杂交实验  41-43
    2.2.4 重组蛋白的表达与提纯  43-45
    2.2.5 酶联免疫吸附测定  45-46
    2.2.6 蛋白沉降实验（Pull-down）  46-47
    2.2.7 圆二色谱分析  47
    2.2.8 流式细胞术  47-48
  2.3 实验结果  48-60
    2.3.1 POB1的C端60个氨基酸残基是gp41的结合位点  48-50
    2.3.2 POB1主要与gp41的六螺旋结构和NHR功能区相互作用  50-57
    2.3.3 C60在溶液中主要呈现螺旋结构  57-58
    2.3.4 C60能够结合细胞表面天然状态下的gp41  58-60
  2.4 本章小结与讨论  60-63
第3章 C60 抗 HIV-1 感染活性的研究  63-82
  3.1 本章引言  63
  3.2 实验材料和方法  63-66
    3.2.1 C60对融合活性六螺旋形成抑制效果的检测  63-64
    3.2.2 C60对膜融合介导的合胞体形成的抑制实验  64-65
    3.2.3 C60对HIV-1病毒侵染靶细胞的抑制活性的检测  65
    3.2.4 C60细胞毒性检测  65-66
  3.3 实验结果  66-77
    3.3.1 C60并不能抑制融合活性六螺旋的形成  66-70
    3.3.2 C60能够抑制HIV-1 gp41介导的合胞体形成  70-73
    3.3.3 C60能够抑制HIV-1病毒感染  73-76
    3.3.4 C60对实验用细胞没有细胞毒性作用  76-77
  3.4 本章小结与讨论  77-82
第4章 HIV-1 gp41 影响 POB1 参与的内吞过程的初步研究  82-97
  4.1 本章引言  82-83
  4.2 实验材料和方法  83-85
    4.2.1 POB1与gp41的免疫共沉淀实验  83-84
    4.2.2 HIV-1 gp41对内吞过程的影响  84-85
    4.2.3 Gp41对CD4-的A431细胞摄入HIV-1假病毒能力的影响  85
  4.3 实验结果  85-94
    4.3.1 HIV-1 gp41与POB1全长蛋白的结合  85-88
    4.3.2 HIV-1 gp41能够增强细胞内吞作用  88-92
    4.3.3 Gp41能够增强A431细胞摄入HIV-1假病毒颗粒  92-94
  4.4 本章小结与讨论  94-97
第5章结论  97-99
  5.1 研究工作总结  97-98
  5.2 接下来开展的工作  98-99
参考文献  99-117
致谢  117-119
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  119

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