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诺如病毒GⅡ型流行株基因组特征分析及进化机制研究

作　者: 薛亮
导　师: 吴清平
学　校: 华南理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 诺如病毒 分子检测 污染调查 病毒基因组 进化机制
分类号: R373.25
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


诺如病毒（Norovirus, NoV）是全球非细菌性腹泻的主要病因。1968年NoV被首次报道，至上世纪90年代中期GⅡ.4型NoV成为了全球主要流行株，并且此后每隔两三年就产生变异株并引起新一轮传播，因此也被成为“肠胃炎流感”。近年来我国NoV疫情频繁暴发，对抗病毒研究提出了更紧迫的要求，然而NoV体外复制体系的缺乏增加了病毒研究的困难。检测技术的发展，尤其是PCR技术的应用，对NoV传播特点与分布规律研究具有重要意义。同时，PCR技术还促进了NoV序列的积累，这不但有助于了解病毒基因组特征，而且加深对其进化机制的认识。近年来有学者提出，宿主对病毒感染的的免疫保护作用以及人类血型组织抗原作为病毒受体是NoV进化的两大约束性因素。NoV序列的积累已经成为了病毒进化及抗病毒研究的基础，因此本论文以病毒序列为中心，分别针对检测技术开发、病毒污染调查、基因组序列克隆、病毒序列进化分析等内容展开研究，具体工作如下：1、NoV检测技术标准化研究。在构建通用性DNA/RNA质控品的基础上，优化并评价了不同引物、不同类型的RT-PCR检测NoV技术，建立了各种方法检测灵敏度的对应关系，为实际工作中选择合适的检测方法提供了参考依据。此外，还比较了不同方法抽提病毒核酸的差异，其中膜纯化方法效果最佳，同时考察了膜层析、超滤浓缩及免疫板捕获病毒等前处理方法回收病毒的效果。2、广州地区冬季散发性腹泻中病毒感染调查。调查了广州地区冬季散发性腹泻样本中的病毒感染状况，从89份样本中检出9份NoV阳性和32份轮状病毒阳性。对病毒部分聚合酶区及衣壳蛋白区的序列分析显示，所有NoV均为GⅡ基因型，其中GⅡ.4型占5/9，GⅡ.6型占3/9，另外还包括一株GⅡ.b/GⅡ.3重组株。3、GⅡ型NoV基因组序列克隆与特征分析。建立了一种简单通用的GⅡ型NoV基因组克隆方法，并克隆得到3条我国华南地区不同型别NoV流行株的基因组序列。同时，收集已公布的GⅡ型NoV基因组，分析其不同蛋白编码区的同源性及进化特征差异，结果显示p22蛋白、P2区和VP2蛋白为易变异区域，进一步对以上区域进行系统发育分析，提示VP1与VP2蛋白可能存在共进化现象。4、GⅡ.4型NoV衣壳蛋白进化分析。收集已公布的GⅡ.4型NoV衣壳蛋白序列，通过多重序列比对筛选病毒进化中出现的信息位点，分析其中的关键位点及其在病毒衣壳上的分布，然后借助同源建模比较不同GⅡ.4型NoV流行株P蛋白的结构差异，计算关键位点的表面积变化情况，从而分析了各位点的氨基酸使用范围，并预测衣壳蛋白上可能的抗原表位。病毒检测技术开发和序列信息积累是NoV研究的重要工具，因此，本论文围绕NoV序列展开研究，建立了标准的RT-PCR检测NoV技术，并应用于临床样本调查，同时克隆、分析了GⅡ型NoV的基因组序列特征，最后对主要流行GⅡ.4型NoV衣壳蛋白序列的进化机制进行探索。NoV高流行性和易变异的特征对认识病毒提出了迫切的需求，本论文关于病毒检测及进化机制的研究不仅有助于预测NoV的进化趋势，也将为开发有效的病毒疫苗和治疗手段提供重要的理论指导。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-15
第一章 绪论  15-44
  1.1 病原学  15-16
  1.2 分子生物学  16-18
    1.2.1 基因组特征  16
    1.2.2 遗传多样性  16-17
    1.2.3 结构蛋白  17-18
  1.3 衣壳蛋白  18-23
    1.3.1 外源表达  18-19
    1.3.2 受体结合  19-23
  1.4 病毒进化  23-31
    1.4.1 基因重组  24-25
    1.4.2 突变进化  25-28
    1.4.3 影响因素  28-31
  1.5 食品安全  31-34
    1.5.1 食品  31-32
    1.5.2 水源  32-33
    1.5.3 环境影响  33-34
  1.6 检测方法  34-41
    1.6.1 病毒提取  34-37
    1.6.2 核酸抽提  37
    1.6.3 电镜观察  37-38
    1.6.4 免疫检测  38
    1.6.5 PCR 检测  38-41
  1.7 未来研究方向  41-42
  1.8 本论文的目的意义与研究内容  42-44
    1.8.1 目的意义  42
    1.8.2 研究内容  42-43
    1.8.3 技术路线  43-44
第二章 诺如病毒检测技术的标准化研究  44-77
  2.1 材料  44-47
    2.1.1 阳性样本  44-45
    2.1.2 质粒与菌株  45
    2.1.3 分子试剂  45
    2.1.4 其他试剂  45
    2.1.5 常用溶液  45-47
    2.1.6 主要仪器  47
  2.2 方法  47-56
    2.2.1 检测引物  47-48
    2.2.2 RNA 抽提  48-50
    2.2.3 反转录  50
    2.2.4 常规 PCR  50
    2.2.5 一步法 RT-PCR  50
    2.2.6 实时荧光定量 RT-PCR  50-51
    2.2.7 核酸电泳  51
    2.2.8 凝胶回收  51
    2.2.9 TA 克隆  51-52
    2.2.10 菌落 PCR  52
    2.2.11 核酸序列测定  52
    2.2.12 标准质粒构建  52-53
    2.2.13 标准 cRNA 制备  53
    2.2.14 病毒定量方法  53
    2.2.15 电镜观察  53-54
    2.2.16 核酸稳定性  54
    2.2.17 超滤浓缩法  54
    2.2.18 膜层析吸附法  54-55
    2.2.19 酶联免疫板捕获病毒法  55
    2.2.20 病毒回收率与浓缩倍数  55
    2.2.21 质量控制  55-56
    2.2.22 统计学分析  56
  2.3 结果  56-71
    2.3.1 电镜观察  56
    2.3.2 标准质粒的构建  56-57
    2.3.3 常规 PCR 引物扩增体系优化  57-58
    2.3.4 常规 PCR 引物检测灵敏度评价  58-59
    2.3.5 两步法实时荧光定量 RT-PCR 扩增体系优化  59-60
    2.3.6 两步法实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线建立  60-61
    2.3.7 标准 cRNA 的制备  61
    2.3.8 反转录体系优化  61-63
    3.3.9 RTPCRU 与 PCRU 比较  63
    2.3.10 一步法实时荧光定量 RT-PCR 扩增体系优化  63-64
    2.3.11 一步法实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线建立  64-67
    2.3.12 RNA 提取效果评价  67-68
    2.3.13 NoV 核酸稳定性研究  68-69
    2.3.14 超滤浓缩法富集 NoV  69
    2.3.15 膜层析吸附法富集 NoV  69-70
    2.3.16 酶联免疫板捕获 NoV 法  70-71
  2.4 讨论  71-75
  2.5 小结  75-77
第三章 广州市冬季散发性腹泻中诺如病毒污染调查  77-87
  3.1 材料  77-78
    3.1.1 临床样本  77-78
    3.1.2 质粒与菌株  78
    3.1.3 分子试剂  78
    3.1.4 其他试剂  78
    3.1.5 主要仪器  78
  3.2 方法  78-81
    3.2.1 检测与克隆引物  78-79
    3.2.2 临床样本处理  79
    3.2.3 RNA 抽提  79
    3.2.4 反转录  79
    3.2.5 常规 PCR  79
    3.2.6 一步法 RT-PCR  79-80
    3.2.7 核酸电泳  80
    3.2.8 凝胶回收  80
    3.2.9 TA 克隆  80
    3.2.10 菌落 PCR  80
    3.2.11 核酸序列测定  80
    3.2.12 序列分析与系统发育树建立  80
    3.2.13 病毒序列号  80-81
  3.3 结果  81-84
    3.3.1 病毒感染状况  81
    3.3.2 NoV 序列比对与系统发育树建立  81-83
    3.3.3 NoV 衣壳蛋白序列同源性分析  83-84
  3.4 讨论  84-86
  3.5 小结  86-87
第四章 GⅡ 型诺如病毒基因组克隆与序列分析  87-123
  4.1 材料  88
    4.1.1 阳性样本  88
    4.1.2 质粒与菌株  88
    4.1.3 分子试剂  88
    4.1.4 其他试剂  88
    4.1.5 主要仪器  88
  4.2 方法  88-93
    4.2.1 参考毒株序列的选择与预分型  88
    4.2.2 基因组克隆策略与引物列表  88-89
    4.2.3 GⅡ 型 NoV 基因组片段扩增  89
    4.2.4 3′-cDNA 末端快速克隆技术  89-90
    4.2.5 基因组片段克隆  90
    4.2.6 核苷酸序列测定  90
    4.2.7 基因组序列拼接、分析与系统发育树建立  90
    4.2.8 基因组序列代表株选择与基因注释分析  90-91
    4.2.9 序列同源性分析  91
    4.2.10 序列进化分析  91
    4.2.11 参照病毒序列号  91-93
  4.3 结果  93-118
    4.3.1 GⅡ 型 NoV 基因组序列收集  93-95
    4.3.2 GⅡ 型 NoV 基因组扩增引物设计  95-96
    4.3.3 基因组片段扩增结果  96-97
    4.3.4 基因组扩增引物的灵敏度比较  97
    4.3.5 实际样本中 GⅡ 型 NoV 基因组克隆与序列测定  97-98
    4.3.6 NoV 基因组结构特征  98-99
    4.3.7 基因组序列分析与系统发育树构建  99
    4.3.8 GⅡ.4 型 NoV 蛋白序列分析  99-111
    4.3.9 GⅡ 型 NoV 蛋白序列分析  111-118
  4.4 讨论  118-122
  4.5 小结  122-123
第五章 GⅡ.4 型诺如病毒衣壳蛋白进化分析  123-158
  5.1 材料  123
  5.2 方法  123-125
    5.2.1 序列分型及比对分析  123-124
    5.2.2 氨基酸位点的熵值计算  124
    5.2.3 系统发育树的构建  124-125
    5.2.4 同源建模与定位  125
  5.3 结果  125-152
    5.3.1 GⅡ.4 型 NoV 衣壳蛋白序列收集  125-127
    5.3.2 衣壳序列中变异位点筛选  127-129
    5.3.3 各基因簇内部变异位点分析  129-135
    5.3.4 变异位点分类  135-139
    5.3.5 同源建模  139-141
    5.3.6 变异位点表面积计算  141-146
    5.3.7 抗原表位预测及其进化特征分析  146-152
  5.4 讨论  152-156
  5.5 小结  156-158
结论与展望  158-161
参考文献  161-180
附录  180-183
攻读博士学位期间取得的研究成果  183-185
致谢  185-186
答辩委员会对论文的评定意见  186

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