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基因Ⅸ型新城疫病毒病原学监测与不同禽源分离株毒力和遗传进化研究

作　者: 段旭基
导　师: 杨增岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒 基因Ⅸ型 遗传进化 监测 病原 毒力
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


新城疫（Newcastle disease ND）因其全球广泛分布和对养禽业危害巨大著称为禽类主要的传染病，其病原新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）被列入禽副黏病毒1型，属禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）、副黏病毒科（Paramyxovirudae），单股负链有囊膜RNA病毒，长约15.2kb。NDV F蛋白裂解位点序列和HN蛋白是其主要的毒力决定因素。基于致病指数，NDV毒株被分为强毒型（velogenic）、中毒型（mesogenic）、无毒（或弱毒）型（apathogenic, or lentogenic）。“早期”基因Ⅸ型NDV基因组长15192nt，包括中国官方标准强毒株F48E9，代表了NDV独特地域分布型。基因Ⅸ型NDV自1946年在国内流行以来，直到上世纪80年代免疫计划实施，在过去的30年里基因Ⅸ型引起家禽ND零星散发，然而，近年来，基因Ⅸ型NDV从水禽中分离。尽管不同地域分布的不同基因型NDV在全球范围内演义持续性同步进化，但基因Ⅸ型NDV流行病学和进化依然是个谜团，这归咎于已报道不同宿主数量不多的分离株。研究野鸟源和家禽源基因Ⅸ型NDV流行病学和遗传进化，对于阐述基因Ⅸ型NDV总体进化规律、野鸟与家禽在NDV进化中扮演的角色以及防控ND暴发具有重要意义，研究内容和结果为以下四部分：1.秦岭北麓野鸟源基因Ⅸ型NDV病原学监测和分离株毒力分析为评估秦岭北麓野鸟源基因Ⅸ型NDV流行及毒力情况，对2008年8月到2011年7月间采集于健康野鸟的374份咽喉、泄殖腔拭子进行NDV分离与鉴定，对分离株进行生物学特性和遗传进化分析。获得5株NDV（包括2株候鸟源），分别命名为Peafowl/China/08、WhooperSwan/China/08、Blackbird/China/08、SpottedDove/China/08、White-cheekedStarling/China/08。F基因（535bp）序列分析显示，5株NDV均具有强毒F蛋白裂解位点序列112R-R-Q-R-R-F117，致病指数MDT、ICPI和IVPI差异较大，分别为37.2h～64.8h，0.425～1.638，2.04～2.76，珠颈斑鸠（鸠鸽属）分离株SpottedDove/China/08显示F蛋白强毒裂解位点序列112R-R-Q-R-R-F117与弱毒ICPI的不统一。F基因（535bp）同源性分析显示5株NDV同源性高达99.8%～100%。F基因（42～420nt，374bp）进化树分析显示5株野鸟NDV分离毒均属于我国特有的基因IX型NDV，与国内早期基因Ⅸ型NDV流行株F48E9亲缘关系很近（核苷酸同源性为99.4%～99.6%），而与传统疫苗株La Sota和V4及当前国内家禽中流行的基因Ⅶ型NDV毒株亲缘关系较远。研究表明相当数量种属的野鸟对基因Ⅸ型NDV有自然抵抗力，野鸟被证实为基因Ⅸ型NDV强毒株携带者，可能充当NDV“飞行器”角色，加速基因Ⅸ型NDV跨区传播，并一度在秦岭北麓多种野鸟中流行。2.陕西省部分商业鸡群基因Ⅸ型NDV病原学监测和分离株毒力分析为了评价陕西省商业鸡群基因Ⅸ型新城疫病毒（NDV）流行及毒力情况，对2009年6月到2012年7月间采集于陕西省境内34个商业鸡群的160份组织和咽喉-泄殖腔拭子进行NDV分离与鉴定，从长安和榆林两蛋鸡场分离获得2株NDV，分别命名为Layer/China/Changan/10和Layer/China/Yulin/10，并对分离株进行生物学特性和遗传进化分析。2株NDV致病指数MDT、ICPI各不相同，分别为56.3h和7.2h，1.603和1.838。F基因（535bp）推导氨基酸同源性分析显示2株家禽NDV均具有强毒融合（F）蛋白裂解位点112R-R-Q-R-R-F117，且两株同源性高达99.8%，与前期5株野鸟基因Ⅸ型NDV同源性高达99.6%～99.8%。F基因高变区（42～420nt，374bp）分析显示，2株家禽NDV属于我国特有的基因Ⅸ型NDV，与国内早期基因Ⅸ型NDV流行株F48E9亲缘关系很近（核苷酸同源性为99.3%～99.4%），而与传统疫苗株La Sota和V4及当前家禽中流行的基因Ⅶ型NDV毒株亲缘关系较远。本研究从野鸟源采样区周边商业鸡群分离到基因Ⅸ型NDV毒株，表明基Ⅸ型NDV强毒株仍可引起鸡群ND暴发，证实基因Ⅸ型NDV在秦岭北麓陕西省家禽中流行。3.基因Ⅸ型NDV分离株主要毒力基因遗传进化分析对7株基因Ⅸ型NDV分离株F和HN基因ORF进行克隆测序，以GenBank不同时期登录家禽和水禽基因Ⅸ型毒株为参考，进行同源性、氨基酸置换类型、遗传变异、进化距离和分子特性研究。H和HN基因同源性分析显示7株分离毒F基因同源高达99.6%～99.9%，与参考株同源性为99.6～99.9%；7株分离毒HN基因同源高达99.3%～100%，与参考株HN基因同源性为99.3～99.9%；包括分离株在内，大部分基因Ⅸ型毒株享有同源性99.0%以上，表明基因Ⅸ型NDV存在种间传播风险。23株基因Ⅸ型F基因间估算平均进化距离为0.012，7株基因Ⅸ型NDV毒株估算进化距离均接近（低于）估算平均进化距离0.012。14株基因Ⅸ型毒株HN基因估算平均进化距离0.007，除Layer/China/Changan/10株，其他6株分离株HN基因估算进化距离均接近于与基因Ⅸ型毒株间HN基因估算平均进化距离0.007。遗传进化研究表明7株分离毒F、HN基因存在少量无意义的点突变和氨基酸置换，其主要毒力基因演义无明显差异的同步进化。而基因Ⅸ型内较大进化距离表明水禽在基因Ⅸ型NDV进化中扮演着积极角色。4.不同禽类基因Ⅸ型NDV分离株基因组遗传进化研究为了深度评估野鸟源和家禽源基因Ⅸ型NDV分离株遗传进化关系，以GenBank已登录基因Ⅸ型NDV毒株和和本实验室SpottedDove/China/08株全基因序列为参考，运用RT-PCR技术对野鸟源Blackbird/China/08株和家禽源Layer/China/Yulin/10株进行全基因扩增测序。运用DNAstar5.0及MEGA5.2软件，对Blackbird/China/08株和Layer/China/Yulin/10株进行分析，结果显示两株基因Ⅸ型NDV病毒基因组全长均为15192bp，基因组结构均包含3′-Leader-NP-P-M-F-HN-L-Trailer-5′；F蛋白的裂解位点及HN蛋白长度均符合NDV强毒特征；全基因序列进化树显示两株NDV依旧属于基因Ⅸ型NDV。基因Ⅸ型NDV毒株遗传进化距离研究表明，NP、P、M、F、HN、L和V基因进化水平并不是完全与基因组进化水平保持一致，而是相对接近（略高于或低于）与基因组进化水平，HN基因和V基因的进化水平要略高于NP、P、M、F和L基因。基因组进化水平显示基因Ⅸ型NDV是极度保守的，但不否认一些水禽基因Ⅸ型NDV毒株在基因Ⅸ型进化中先行地位；V基因间进化距离作为NDV毒力增强标准有待证实。基因Ⅸ型分离株Blackbird/China/08、Layer/China/Yulin/10和SpottedDove/China/08株基因组进化水平低于（接近）基因Ⅸ型毒株估总体平均进化水平，基因Ⅸ型毒株中家禽源毒株受免疫选择压力影响进化水平要高于野鸟源基因IX型毒株；野鸟被推测是基因Ⅸ型NDV强毒株贮存宿主，加速了基因Ⅸ型NDV扩散和传播。综上所述，本研究与2008年8月至2012年7月间在秦岭北麓及陕西省境内分离到7株不同禽源、毒力差异的基因Ⅸ型NDV毒株，包括一株分离于珠颈斑鸠（鸠鸽属）的弱毒株SpottedDove/China/08。野鸟被推测为基因Ⅸ型NDV强毒株贮存宿主，在加速基因Ⅸ型NDV扩散传播中起了“飞行器”作用；在过去30年里，野鸟演义了基因Ⅸ型NDV进化史和流行病史；基因Ⅸ型NDV进化水平相对较低，各基因进化水平并不是完全与基因组进化水平保持一致，而是相对接近（略高于或低于）与基因组进化水平，HN基因和V基因的进化水平要略高于NP、P、M、F和L基因，家禽源毒株因疫苗免疫压力影响，其进化水平高于野鸟源基因Ⅸ型毒株；本研究基因Ⅸ型分离株进化水平低（或接近）于基因Ⅸ型NDV总体进化水平；证实基因Ⅸ型NDV一度在秦岭北麓和关中地区家禽和野鸟间流行；一些水禽源基因Ⅸ型NDV毒株在基因Ⅸ型进化中处于先行；V基因间进化距离作为NDV毒力增强标准有待证实。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-16
第一章 新城疫病毒流行病学与遗传进化研究进展  16-44
  1.1 NDV 病原学  16-26
    1.1.1 生物学地位  16
    1.1.2 病毒形态  16
    1.1.3 理化特性  16-17
    1.1.4 生物活性  17-19
    1.1.5 病毒培养特性  19
    1.1.6 分子生物学特性  19-26
  1.2 血清学与基因分型  26-28
  1.3 NDV 分子致病性基础  28-29
  1.4 流行及进化史  29-39
    1.4.1 NDV 感染谱系  29-30
    1.4.2 NDV 传播途径  30
    1.4.3 NDV 流行史  30-33
    1.4.4 NDV 进化  33-39
  1.5 NDV 诊断  39
  1.6 NDV 免疫  39-41
    1.6.1 禽免疫器官  40
    1.6.2 禽免疫机理  40-41
  1.7 NDV 疫苗  41-43
    1.7.1 疫苗种类  41-42
    1.7.2 NDV 疫苗免疫现状  42-43
  1.8 研究的目的与意义  43-44
第二章 秦岭北麓野鸟源基因Ⅸ型 NDV 病原学监测与分离株毒力分析  44-59
  2.1 材料和方法  44-49
    2.1.1 主要仪器  44-45
    2.1.2 材料  45
    2.1.3 培养基  45-46
    2.1.4 生物信息学分析软件  46
    2.1.5 样品  46
    2.1.6 血清学鉴定  46-47
    2.1.7 毒力指数测定  47
    2.1.8 RT-PCR 鉴定及序列分析  47-49
    2.1.9 序列测定与分析  49
  2.2 结果  49-57
    2.2.1 鉴定结果  49-52
    2.2.2 野鸟源 NDV 分离株命名  52
    2.2.3 分离株毒力指数测定  52
    2.2.4 分离株 F 基因片段的分子特征  52-54
    2.2.5 分离株 F 基因同源性分析  54-55
    2.2.6 野鸟源分离株 F 基因系统进化分析  55-57
  2.3 讨论  57-58
  2.4 小结  58-59
第三章 陕西省部分商业鸡群基因Ⅸ型 NDV 病原学监测与分离株毒力分析  59-73
  3.1 材料和方法  59-63
    3.1.1 主要仪器  59
    3.1.2 材料试剂  59-60
    3.1.3 培养基  60
    3.1.4 生物信息学分析软件  60-61
    3.1.5 病料样品  61
    3.1.6 血清学鉴定  61
    3.1.7 分离株毒力指数测定  61
    3.1.8 RT-PCR 鉴定及序列分析  61-63
    3.1.9 序列测定与分析  63
  3.2 结果  63-71
    3.2.0 基因Ⅸ型 NDV 分离  63-64
    3.2.1 分离株背景信息及 HA 、HI 试验  64-65
    3.2.2 分离株 MDT 与 ICPI 测定结果  65
    3.2.3 分离株 F 基因片段扩增  65-66
    3.2.4 分离株 F 蛋白裂解位点分析  66-68
    3.2.5 蛋鸡分离株同源型分析  68-69
    3.2.6 蛋鸡源 NDV 分离株遗传进化分析  69-71
  3.3 讨论  71-72
  3.4 小结  72-73
第四章 基因Ⅸ型 NDV 分离株主要毒力基因遗传进化分析  73-101
  4.1 材料试剂  73-75
    4.1.1 仪器  73
    4.1.2 病毒尿囊液  73-74
    4.1.3 主要试剂  74
    4.1.4 培养基  74
    4.1.5 基因Ⅸ型分离株  74-75
    4.1.6 生物信息分析软件  75
  4.2 实验方法  75-77
    4.2.1 F、HN 基因引物设计  75
    4.2.2 RNA 提取及 RT-PCR  75-76
    4.2.3 pMD-18T 载体连接与重组质粒酶切鉴定  76-77
    4.2.4 基因Ⅸ型株分离株 F、HN 序列测定分析  77
  4.3. 结果  77-98
    4.3.0 分离株 F、HN 基因片段的分子特征  77-79
    4.3.1 分离株 F、HN 基因序列登录号  79-80
    4.3.2 GenBank 基因Ⅸ型参考株  80-81
    4.3.3 基因Ⅸ型毒株 F 蛋白裂解位点  81-82
    4.3.4 分离株 F、HN 基因同源性分析  82-87
    4.3.5 基因Ⅸ型 NDV 进化树分析  87-89
    4.3.6 分离株毒力基因突变及氨基酸置换  89-95
    4.3.7 基因Ⅸ型 NDV 毒株毒力基因进化距离  95-98
  4.4 讨论  98-100
  4.5 小结  100-101
第五章 不同禽源基因 Ⅸ 型 NDV 分离株全基因测序及遗传进化分析  101-131
  5.1 材料试剂  101-103
    5.1.1 仪器  101
    5.1.2 毒株  101-102
    5.1.3 SPF 鸡胚  102
    5.1.4 主要试剂  102
    5.1.5 培养基  102-103
    5.1.6 生物信息分析软件  103
  5.2 方法  103-108
    5.2.1 基因引物设计  103-106
    5.2.2 病毒增殖  106
    5.2.3 RNA 提取及 RT-PCR  106-107
    5.2.4 载体连接与重组质粒酶切鉴定  107
    5.2.5 基因Ⅸ型分离株全基因序列分析  107-108
  5.3 结果  108-128
    5.3.1 全基因片段 PCR 扩增  108
    5.3.2 LA/CHINA/YULIN/10 毒株全基因组特征  108-111
    5.3.3 全基因组推导氨基酸置换  111-114
    5.3.4 F 蛋白的特征分析  114
    5.3.5 HN 蛋白的特征分析  114-118
    5.3.6 V 蛋白分析  118
    5.3.7 全基因组的特征分析  118-119
    5.3.8 全基因的遗传进化分析  119-120
    5.3.9 估算平均进化距离分析  120-128
  5.4 讨论  128-130
  5.5 小结  130-131
第六章 结论与主要创新点  131-133
  6.1 结论  131
    6.1.1 分离毒株  131
    6.1.2 野鸟作用  131
    6.1.3 基因Ⅸ型 NDV 进化评估  131
    6.1.4 分离株毒力和进化状况  131
    6.1.5 基因Ⅸ型 NDV 流行病史  131
  6.2 创新  131-133
    6.2.1 丰富基因Ⅸ型 NDV 毒株信息  131
    6.2.2 评估基因Ⅸ型 NDV 遗传进化  131-132
    6.2.3 披露基因Ⅸ型 NDV 流行史  132-133
参考文献  133-149
附录  149-151
英文缩略词及中英文对照  151-153
致谢  153-154
作者简介  154

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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