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表达FMDV-VP1重组PPRV的构建及生物学特性与免疫应答研究

作　者: 印春生
导　师: 夏春
学　校: 中国农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 小反刍兽疫病毒反向遗传口蹄疫病毒 VP1 重组疫苗
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)和小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是严重危害山羊、绵羊等家养和野生反刍动物的两种烈性病毒性传染病,分别由口蹄疫病毒(FMDV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)引起。在我国,FMD和PPR均被列为一类动物传染病,疫苗免疫是防控此两种疫病的重要手段。灭活疫苗广泛应用于羊的FMD免疫预防,但其存在免疫期短、成本昂贵、不能完全阻止病毒在体内复制等不足。PPR弱毒疫苗N75/1株已被证明安全、有效,广泛应用于亚、非等PPR流行国家和地区。包括中国在内的广大发展中国家同时存在FMD和PPR流行,给养羊业造成重大经济损失。采用N75/1株为载体,研制表达FMDV保护性抗原的重组病毒活疫苗,有可能实现一种活疫苗预防PPR和FMD两种疫病,不仅有利于降低FMD防疫成本,提高FMD免疫覆盖率,而且弥补了灭活疫苗缺乏激活细胞介导免疫反应的不足。本研究旨在验证上述疫苗技术策略的可行性。为此,本研究首先以亚洲1型FMD疫苗毒株所提取的RNA为模板,以合成的VP1特异性引物进行RT-PCR扩增,获得了该毒株的VP1基因,并将其连接至pET-21a载体后进行表达。将纯化的VP1蛋白免疫大耳白兔制备了多克隆抗体,ELISA测定其抗体效价为1：8192。同时,应用表达纯化的VP1蛋白作为包被抗原建立了检测牛亚洲1型FMDV抗体的间接ELISA方法。再利用已经建立的PPRV/N75/1株反向遗传操作系统,构建了表达亚洲1型FMDV-VP1蛋白的重组PPRV。构建简要过程为先在pN75/1-insertion质粒载体的P和M基因之间插入了亚洲1型FMDV-VP1基因,构建了pN75/1-VP1重组质粒,再将pN75/1-VP1质粒、pCA-N、 pCA-P和pCA-L共转染入Vero细胞,获得了重组病毒,命名为rPPRV-VP1。rPPRV-VP1在Vero细胞上的生长曲线与PPRV/N75/1相似,病毒含量达107.7TCID50/mL; IFA和Western-blot分析证实VP1蛋白在rPPRV-VP1感染Vero细胞获得正确表达；将rPPRV-VP1在Vero细胞上连续传25代次,对不同代次病毒液的病毒含量测定和RT-PCR分析,证明rPPRV-VP1在传代过程中能够保持稳定表达重组VP1蛋白,显示出良好的遗传稳定性。为验证rPPRV-VP1对免疫靶动物的安全性和研究抗体持续期,采用6×107TCID50剂量颈部皮下接种5只山羊,持续观察28日。结果表明rPPRV-VP1对山羊具有良好的安全性；同时以6×106TCID50接种山羊后定期采血检测PPRV和FMDV中和抗体,结果表明,接种后第56日两种病毒中和抗体效价均达到峰值,并能够维持到接种后140日无明显下降。最后对rPPRV-VP1的免疫原性及其对FMDV的攻毒保护效力进行了评价。rPPRV-VP1和N75/1疫苗株分别按6×106TCID50剂量,分别颈部皮下接种健康易感山羊和牛,接种后定期采血检测PPRV和FMDV的中和抗体,并在免疫后接种亚洲1型FMDV强毒进行FMD攻毒保护效力测定。羊的试验结果为,接种后第14日,所有rPPRV-VP1接种羊PPRV和亚洲1型FMDV中和抗体均转为阳性；PPRV/N75/1接种照羊PPRV中和抗体全部转阳,但FMDV中和抗体保持阴性；两组羊的PPRV中和抗体滴度无显著差异。接种后第40日时进行攻毒,观察10日,接种PPRV/N75/1的4只羊均表现出典型FMD症状；接种rPPRV-VP1的6只羊中,4只羊观察期间无任何口蹄疫症状,另2只羊的发病时间延迟,且症状较PPRV/N75/1组羊明显较轻。牛的试验结果为,接种rPPRV-VP1的5头牛均诱导产生显著的亚洲1型FMDV中和抗体,而PPRV/N75/1接种的2头牛均未产生FMDV抗体。接种后第21日时进行攻毒,观察10日,接种PPRV/N75/1的2头牛均表现典型的FMD症状,接种rPPRV-VP1的5头牛中有2头未发现FMD症状,另3头牛和PPRV/N75/1接种牛相比FMD发病时间推迟,症状显著减轻。总结,本研究利用PPRV/N75/1株反向遗传系统,构建了表达亚洲1型FMDV-VP1的重组病毒rPPRV-VP1。rPPRV-VP1接种山羊安全性良好；接种山羊和牛均可诱导产生PPRV和FMDV中和抗体,并能够产生对亚洲1型FMDV强毒的攻击的免疫保护。结果证明,PPRV/N75/1株作为构建FMD活载体疫苗具有技术可行性,有可能实现一种活病毒疫苗同时预防PPR和FMD两种重大动物疫病。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
插图和附表清单  11-13
缩略词表  13-15
第一章引言  15-40
  1 小反刍兽疫概述  15-20
  2 口蹄疫概述  20-23
  3 反向遗传技术在副粘病毒研究中的应用  23-30
  4 口蹄疫新型疫苗研究进展  30-38
  5 研究的目的及意义  38
  6 研究内容  38-39
  7 研究目标  39-40
第二章亚洲1型FMDV-VP1蛋白抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立  40-62
  1 前言  40
  2 材料  40-45
  3 方法  45-53
  4 结果  53-60
  5 讨论  60-61
  6 小结  61-62
第三章表达亚洲1型FMDV-VP1基因的重组PPRV的构建与鉴定  62-79
  1 前言  62
  2 材料  62-64
  3 方法  64-71
  4 结果  71-77
  5 讨论  77-78
  6 小结  78-79
第四章 rPPRV-VP1的生物学特性及免疫原性研究  79-93
  1 前言  79
  2 材料  79-80
  3 方法  80-84
  4 结果  84-90
  5 讨论  90-92
  6 小结  92-93
第五章 rPPRV-VP1免疫羊和牛后的FMDV攻毒保护性研究  93-108
  1 前言  93
  2 材料  93-94
  3 方法  94-97
  4 结果  97-105
  5 讨论  105-107
  6 小结  107-108
第六章结论和创新点  108-109
  1 结论  108
  2 创新点  108-109
参考文献  109-123
致谢  123-125
作者简介  125

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