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南极低温酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中海藻糖的合成与调控

作　者: 张芳
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 耐冷酵母 Guehomyces pullulans17-1 6-磷酸海藻糖合成酶 TPS1基因 TPS2基因
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

据报道，生物圈内80%的地区气温都低于5oC。低温和较少可利用的液态水，使得这些地区不适合大多数生物的生长。然而，嗜冷微生物和耐冷微生物可以在这些地区较好的生存。因此了解这些低温微生物的耐冷机制具有非常重要的意义。最近研究表明，海藻糖不仅可以作为细胞内的储能物质，还可以作为一种高效的保护剂，以增强细胞组分抵抗高温、低温、高渗、高酒精浓度等极端恶劣环境的能力。在酵母细胞中，海藻糖的合成途径分为两步。第一步，UDPG和6-PG在6-磷酸海藻糖合成酶（Tps1）的催化作用下生成6-磷酸海藻糖；第二步，6-磷酸海藻糖在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（Tps2）的作用下生成海藻糖。一般来说，Tps1被胞内的TPS1基因编码，而Tps2被TPS2基因进行编码。在我们之前的实验中，从南极的沉积物中分离纯化得到一株耐冷酵母，经分类鉴定为Guehomyces pullulans17-1菌株，它的最适生长温度为15oC。本研究首先利用简并引物PCR法、反向PCR和基因组步移法从G. pullulans17-1菌株的基因组DNA中克隆出了TPS1基因。克隆的TPS1基因（NCBI的登录号：JX046041）全长1590bp，编码530个氨基酸，预测的蛋白分子量约为59.8kDa，该蛋白质的氨基酸序列与其它真菌的Tps1具有很高的同源性。在TPS1基因的启动子中存在若干个应激反应元件CT4和AG4，这表明TPS1基因的表达会受到逆境诱导。将培养到48h的菌体转移到新鲜的培养基中，然后分别放在10oC、15oC和25oC下培养，结果发现在25oC培养下的菌体内海藻糖的含量、Tps1酶活、TPS1基因的相对表达量比在15oC和10oC培养下的菌体要高，而在10oC培养下的菌体内海藻糖的含量、Tps1酶活、TPS1基因的相对表达量比在15oC和25oC下培养的菌体要低。这说明当G. pullulans17-1菌株处于高温逆境时，会诱导体内产生较多的海藻糖，来帮助细胞抵御高温逆境的影响；而当G. pullulans17-1菌株处于低温逆境时，并不会诱导海藻糖的大量合成。这同时也反映出了低温酵母G. pullulans17-1菌株对高温（＞20oC）比对低温（＜10oC）更加敏感，所以当它处于高温逆境时需要诱导产生大量海藻糖以适应高温环境。同时利用简并引物PCR法和反向PCR法从G. pullulans17-1菌株的基因组DNA中克隆出了TPS2基因的部分序列(NCBI的登录号：KC470041),部分序列长为2376bp，编码792个氨基酸的蛋白质。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-23
  1 低温菌简介  12-15
    1.1 低温菌的分布  12
    1.2 低温菌的嗜冷机制  12-15
  2 海藻糖  15-21
    2.1 海藻糖简介  15
    2.2 海藻糖的分布  15-17
    2.3 海藻糖的生物学功能  17-18
    2.4 真菌海藻糖的生物合成途径  18-19
    2.5 海藻糖的代谢调控  19-21
    2.6 海藻糖的应用  21
  3 本论文的研究内容及意义  21-23
    3.1 本论文的研究目的及意义  21-22
    3.2 本论文的研究内容  22-23
第二章南极低温酵母 G. pullulans 17-1 菌株 6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆和生物学分析  23-50
  1 前言  23
  2 实验材料和方法  23-35
    2.1 实验菌株  23-24
    2.2 培养基和溶液  24-25
    2.3 方法  25-35
  3 结果和讨论  35-49
    3.1 简并 PCR 克隆获得 G. pullulans 17-1 菌株 TPS1 基因的部分序列  35-38
    3.2 反向 PCR 获得 TPS1 基因的部分序列  38-39
    3.3 基因组步移获得 TPS1 基因的全部序列  39-40
    3.4 TPS1 基因序列在 NCBI 的比对结果及对其 ORF 框预测  40-41
    3.5 反转录 PCR  41-42
    3.6 GPTPS1 基因序列的信息学分析  42
    3.7 GPTPS1 基因的启动子  42-44
    3.8 从 GPTPS1 基因推导的 Tps1 蛋白序列的保守性分析  44
    3.9 Tps1 蛋白氨基酸序列糖基化位点分析  44-45
    3.10 Tps1 蛋白氨基酸序列信号肽预测  45-48
    3.11 Tps1 蛋白氨基酸序列系统进化树  48-49
  4 本章小结  49-50
第三章不同温度条件下 G. pullulans 17-1 菌株中海藻糖的积累、Tps1 酶活和 TPS1 基因表达的研究  50-63
  1 前言  50
  2 材料和方法  50-55
    2.1 实验菌株  50
    2.2 培养基和试剂  50-51
    2.3 实验方法  51-55
  3 结果和讨论  55-61
    3.1 不同温度对菌体生长的影响  55-56
    3.2 不同温度下海藻糖含量的变化  56-57
    3.3 不同温度下 6-磷酸海藻糖合成酶活力的变化  57-58
    3.4 荧光定量 PCR  58-60
    3.5 逆境胁迫实验  60-61
  4 本章小结  61-63
第四章 G. pullulans 17-1 菌株 6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因的部分克隆和生物学分析  63-78
  1 前言  63
  2 材料和方法  63-68
    2.1 实验菌株  63
    2.2 培养基和溶液  63-64
    2.3 方法  64-68
  3 结果和讨论  68-77
    3.1 简并 PCR 克隆获得 G. pullulans 17-1 菌株 TPS2 基因部分序列  68-71
    3.2 基因组步移获得 TPS2 基因的部分序列  71-72
    3.3 序列在 NCBI 的比对结果及 TPS2 基因的 ORF 框预测  72-73
    3.4 反转录 PCR  73-74
    3.5 GPTPS2 基因序列的信息学分析  74
    3.6 Tps2 蛋白氨基酸序列糖基化位点分析  74-76
    3.7 Tps2 蛋白氨基酸序列系统进化树  76-77
  4 本章小结  77-78
论文总结与创新点  78-79
  1 论文总结  78
  2. 创新点  78-79
参考文献  79-83
附录：英文缩写符号及中英文对照表  83-84
致谢  84-85
攻读硕士学位期间发表的学术论文  85-86

南极低温酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中海藻糖的合成与调控

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