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Agrobacterium tumefaciens GW4加砷条件下的比较蛋白质组学研究

作　者: 汪雪莲
导　师: 何进
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 砷砷氧化磷蛋白质组学土壤杆菌
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

砷(Arsenic, As)是一种在自然界中广泛分布的剧毒类金属元素,主要以亚砷酸盐As(Ⅲ)和砷酸盐As(Ⅴ)的形式存在,可以通过风化,火山活动,采矿和生物活动释放,造成严重的环境污染。一些原核生物在砷污染环境中不仅发展出砷抗性机制,甚至还能够通过砷氧化产能。微生物对砷的适应性主要依赖不同的砷抗性机制,包括As(Ⅲ)氧化,细胞质As(Ⅴ)还原,呼吸性As(Ⅴ)还原,As(Ⅲ)甲基化。Agrobacterium tumefaciens GW4是本实验室从山西省山阴县的地下水中分离出的一株革兰氏阴性菌,具有砷抗性,能将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ)。在低浓度磷酸盐条件下,菌体可以在将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ)的同时,正常生长,且较无砷条件,具有生长优势。本研究通过双向电泳和质谱鉴定技术建立了A. tumefaciens GW4在低磷浓度分别加砷和无砷条件下的比较蛋白质组研究,根据实验数据对菌体的砷抗性机制,加砷条件下的生长优势,以及其砷磷代谢之间的关系进行了分析。(1)首先对A. tumefaciens GW4的全细胞蛋白的双向电泳条件进行摸索。结合菌株的基因组注释信息和预实验发现pH4-7为最适蛋白分离pH范围。通过菌株生长曲线和As(Ⅲ)氧化曲线的测定,确定了取样时间点为对数中期(17h)和稳定期前期(32h)。(2)通过双向电泳技术分离了有砷和无砷条件下,两个时间点的蛋白样品,选取了凝胶上73个高丰度的差异表达蛋白进行MALDI-TOF-MS分析,最终鉴定得到50个蛋白质。(3)对鉴定出来的蛋白进行功能分类,结果显示57%的蛋白与代谢相关,并主要集中在碳代谢,能量代谢,氨基酸代谢,蛋白质合成与翻译和砷磷代谢。(4)As(Ⅲ)条件下,在对数生条中期,菌体的三羧酸循环受到抑制,而在稳定期时,三羧酸循环上调。对数生长中期菌体正呈指数生长,碳代谢中重要的能量来源减少,磷运输通道蛋白和砷氧化及还原相关蛋白明显上调,说明发生在对数期的砷氧化过程很可能同时为细胞生长提供能量来源。(5)菌体的氨基酸代谢下调,可能是细胞在As(Ⅲ)条件下,菌体内物质的合成由菌体本身生长所需要的物质过渡到菌体适应恶劣环境所需要的物质的合成及形态的转变,比如砷磷代谢相关的运输蛋白和氧化还原蛋白。.本研究首次建立了A. tumefaciens GW4在微量甘露醇培养基(minimal mannitolmediim, MMN)培养基低磷浓度分别加砷和无砷条件下的比较蛋白质组研究。两种条件下差异蛋白的表达水平,菌体的代谢均变化显著,这些改变为解释低磷条件下砷对细菌的生长的促进作用,提供了新的视野。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-12
1 前言  12-26
  1.1 砷与砷污染  12-13
    1.1.1 砷及其化合物  12
    1.1.2 砷的毒性与砷污染  12-13
  1.2 微生物砷抗性机制研究进展  13-16
    1.2.1 微生物砷氧化  13-15
      1.2.1.1 As(Ⅲ)氧化分子机制  13-15
      1.2.1.2 As(Ⅲ)氧化和反硝化偶联供能  15
    1.2.2 细胞质As(Ⅴ)还原  15
    1.2.3 呼吸性As(Ⅴ)还原  15-16
    1.2.4 As(Ⅲ)甲基化  16
  1.3 砷与磷代谢  16-18
    1.3.1 微生物磷运输系统  16-17
    1.3.2 微生物砷与磷代谢的关系  17-18
  1.4 土壤杆菌属(Agrobacterium)研究概况  18
  1.5 蛋白质组学研究进展  18-25
    1.5.1 基因组、转录组和蛋白质组之间的关系  18-20
      1.5.1.1 蛋白质组学  18-19
      1.5.1.2 转录组和蛋白质组学  19
      1.5.1.3 代谢组和蛋白质组学  19-20
    1.5.2 蛋白质组学的研究范畴  20
    1.5.3 蛋白质组学的研究策略  20-21
    1.5.4 蛋白质组分析技术  21-24
      1.5.4.1 依赖于分离的方法  21-23
      1.5.4.2 不依赖于分离的方法  23-24
    1.5.5 微生物蛋白质组学  24-25
      1.5.5.1 加砷条件下的微生物蛋白质组学研究  24-25
  1.6 课题的立题背景及研究目的  25-26
2 材料与方法  26-39
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 菌株的来源  26
    2.1.2 培养基配制及主要的成分  26
    2.1.3 抗生素及砷氧化曲线测定所用试剂  26-27
    2.1.4 引物  27
  2.2 试剂和仪器  27-30
    2.2.1 主要试剂  27-28
    2.2.2 主要试剂的配制  28-29
      2.2.2.1 双向电泳试剂配方  28-29
      2.2.2.2 SDS-PAGE所用溶液  29
    2.2.3 常用仪器  29-30
  2.3 实验方法  30-39
    2.3.1 DNA操作的方法  30
      2.3.1.1 细菌总DNA的提取  30
      2.3.1.2 PCR扩增  30
    2.3.2 TAS-990原子吸收分光光度计及操作规程  30-32
    2.3.3 生长曲线的测定  32
    2.3.4 砷氧化曲线的测定  32
    2.3.5 双向电泳实验操作  32-35
      2.3.5.1 双向电泳样品制备  32
      2.3.5.2 蛋白定量(Bradford法)  32-33
      2.3.5.3 等电聚焦  33-34
      2.3.5.4 SDS-PAGE  34
      2.3.5.5 硝酸银染色(质谱兼容)  34-35
      2.3.5.6 考马斯亮蓝染色(改良版Neuhoff CCB)  35
    2.3.6 图像扫描及分析  35
    2.3.7 A. tumefaciens GW4总RNA的提取  35-36
    2.3.8 实时荧光定量PCR(real-time PCR)  36-39
      2.3.8.1 RNA的定量及质量检测  36
      2.3.8.2 RNA样品中DNA的消化  36
      2.3.8.3 RNA的反转录PCR  36-37
      2.3.8.4 实时荧光定量PCR反应  37-39
3 结果与讨论  39-58
  3.1 A.tumefaciens GW4菌株的蛋白质组学研究  39-41
    3.1.1 双向电泳材料的选取  39
    3.1.2 生长曲线及砷氧化曲线的建立  39-41
  3.2 理论蛋白质图谱分析  41-42
  3.3 双向电泳图谱建立  42-46
  3.4 差异蛋白的质谱鉴定  46-47
  3.5 差异蛋白功能分析  47-48
  3.6 碳水化合物代谢相关蛋白变化分析  48-50
    3.6.1 TCA循环  49-50
    3.6.2 丙酮酸的去向  50
  3.7 氨基酸代谢相关蛋白变化分析  50-51
  3.8 砷磷相关蛋白变化分析  51-58
    3.8.1 As(Ⅴ)还原酶ArsC  53
    3.8.2 钼喋呤生物合成蛋白MoeA  53-54
    3.8.3 FAD依赖的嘧啶核苷酸二硫化物氧化还原酶  54-55
    3.8.4 硫酸盐ABC转运子底物结合蛋白Sbp  55-56
    3.8.5 砷和磷运输相关蛋白  56-58
4 总结  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
附录  67-68

Agrobacterium tumefaciens GW4加砷条件下的比较蛋白质组学研究

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