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丛枝菌根特异AsPT1与AsPT4基因上游激活元件功能分析
作 者: 刘丰川
导 师: 赵斌
学 校: 华中农业大学
专 业: 微生物学
关键词: 丛枝菌根 磷转运基因 农杆菌K599 模体
分类号: Q93
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)共生是一种广泛存在于陆生植物中的一种共生方式,并且能够与80%以上的陆生植物形成共生关系,对植物N、P、Fe、Cu等元素的吸收均具有促进作用,尤其是在P元素吸收方面更为突出,化石分析表明这种共生关系在4.6亿年前就曾存在。当植物与菌根真菌形成共生后,植物便获得了一种新的P吸收途径即菌根真菌途径又称间接吸收途径,通过该途径,植物不仅提高了P吸收效率,同时也扩大了植物在土壤中P吸收的范围。并且研究证实,菌根吸收途径在菌根植物所有P吸收途径中起关键作用(Smith eta1.,2003,2004)。虽然这种共生关系的作用已被广为接受,然而对这种互利共生关系的分子机制并不清楚,本课题致力于研究与菌根有关的磷转运基因的表达调控分析。在实验室已分离的六种P转运基因的基础上,通过表达模式分析,最终分离到两种菌根特异的P转运基因即AsPT1和AsPT4,根据系统进化树分析结果表明,二者均属于Phl磷转运家族;RT-PCR和RT-qPCR分析证实AsPT1和AsPT4基因均为菌根特异型P转运基因,即只有当植物与菌根真菌共生后才能表达。利用生物信息学方法对AsPT1和AsPT4基因的启动子区域进行已知的motif查找定位,以及通过FootPrinter2.0对二者启动子区域进行motif预测分析。通过PCR的方法对启动子进行逐步截断,以及over-lap PCR的方法对motif进行特异敲除,构建以GUS为报告基因的pBI121穿梭载体,利用发根农杆菌K599介导的方法,进行植物转化,转化植株与Glomus intraradices进行共培养一个月,通过TB染色,GUS染色以及GUS酶活检测最终得出结果如下:1、MYCS作为已知的菌根特异的磷转运基因的顺式作用元件,在豆科植物紫云英菌根特异的磷转运基因AsPT1和AsPT4的调控中也具有重要的调控作用。2、AsPT1基因的调控表达较为复杂,存在于其上的TGTT-motitf、 AAAA-motif、TAAT-motif以及MYCS等元件具有协调调节作用,存在正负两种调控方式。TGTT-motif对AsPT1P的驱动活力具有显著调节作用。3、AsPT4基因的调控表达较为简单,存在其上的TAAT-motif及TAAC-motif对AsPT4P驱动活力具有正向调控作用,可能作为一种增强子元件来发挥作用。综上所述,TGTT-motif, AAAA-motif, TAAT-motif及TAAC-motif对豆科植物紫云英中菌根特异的磷转运基因AsPTl和AsPT4具有较为明显的调控作用,而通过直系同源的菌根特异的磷转运基因的启动子序列分析表明,这些元件广泛存在于菌根特异的磷转运基因启动子中,他们可能与MYCS元件类似,具有广泛的调节作用。
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全文目录
目录 4-6 摘要 6-8 Abstract 8-10 1 前言 10-18 1.1 丛枝菌根共生 11-13 1.1.1 丛枝菌根真菌 11-12 1.1.2 菌根真菌共生体的形成 12-13 1.2 植物获取土壤中P的方式 13-14 1.2.1 直接吸收途径 13-14 1.2.2 间接吸收途径 14 1.3 磷转运蛋白(Phosphate transporters PiTs) 14-15 1.3.1 直接吸收途径中的PiTs 14 1.3.2 间接吸收途径中的PiTs 14-15 1.4 顺式作用元件(CREs)与转录因子(TFs)筛选 15-16 1.4.1 顺式作用元件 15-16 1.4.2 转录因子 16 1.5 本研究的主要内容和技术路线 16-18 1.5.1 主要研究内容 16-17 1.5.2 实验技术路线 17-18 2 材料和方法 18-33 2.1 实验材料 18-23 2.1.1 供试土壤 18 2.1.2 供试植物及AM真菌 18 2.1.3 供试试剂 18-22 2.1.4 主要仪器 22-23 2.2 方法 23-33 2.2.1 AsPT全长的克隆 23 2.2.2 盆栽试验 23 2.2.3 植物总RNA的抽提 23-24 2.2.4 TA克隆及测序分析 24-26 2.2.5 RT-PCR and Real-Time PCR 26-27 2.2.6 生物信息学分析 27-28 2.2.7 突变体系载体构建 28 2.2.8 植物转化 28-29 2.2.9 发根农杆菌K599介导的紫云英转化 29-30 2.2.10 转化根中总蛋白提取 30 2.2.11 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 30-31 2.2.12 GUS酶活测定 31-33 3 结果与分析 33-50 3.1 Pht1家族AsPT1和AsPT4基因表达模式分析 33-34 3.2 AsPT基因系统进化分析 34-35 3.3 AsPT1和AsPT4启动子活性分析 35-37 3.4 AsPT基因启动子的生物信息学分析 37-38 3.5 AsPT1和AsPT4启动子的EMSA实验 38-39 3.6 AsPT1P和AsPT4P突变体系构建 39-41 3.7 AsPT1和AsPT4突变体系侵染率 41-43 3.8 AsPT1和AsPT4突变体系GUS检测结果 43-50 3.8.1 AsPT1P突变体系GUS染色结果 43-46 3.8.3 AsPT突变体系GUS根段统计结果 46-47 3.8.4 AsPT1P突变体系GUS酶活检测结果 47-48 3.8.5 AsPT4P突变体系GUS酶活检测结果 48-49 3.8.6 MYCS元件的分析结果 49-50 4 讨论 50-54 4.1 AsPT4启动子中保守元件的功能分析 50-51 4.2 AsPT1启动子中保守元件的分析 51-53 4.3 菌根特异的磷转运基因启动子上保守元件的分布分析 53-54 5 参考文献 54-59 附录 59-64 发表文章 64-65 致谢 65
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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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