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糖皮质激素受体通路在共轭亚油酸诱导的小鼠脂肪组织减少以及二花脸猪高皮质醇耐受中的作用

作　者: 曲晓利
导　师: 李宏基
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 共轭亚油酸围脂滴蛋白糖皮质激素受体糖皮质激素反应元件糖皮质激素高皮质醇耐受 P65 靶基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

共轭亚油酸(CLA)已作为食品添加剂广泛使用，但能够引起小鼠的脂肪营养不良等机体的代谢紊乱。我们以往发现CLA能够显著降低围脂滴蛋白（perilipin1）的表达，并引起小鼠脂肪组织的异常脂解。因此本实验的目的就是为了进一步探讨CLA引起小鼠脂肪组织plin1异常下降的原因。我们对Plin1基因上游的糖皮质激素受体的学位论文">糖皮质激素受体(GR)进行了研究。首先在两组（n=12）6周龄雄性昆明小鼠的日粮中分别添加1.5%的CLA（试验组）或亚油酸（LA，对照组），13天后诱导出脂肪组织减少，测定血浆中皮质醇（cortisol）的含量，检测小鼠附睾脂肪组织中GR的mRNA水平，并且分别克隆小鼠GR启动子和带有GRE的Plin1启动子，让这些启动子控制荧光素酶基因，构建pGL3-GR和pGL3-Plin1（GRE）重组质粒。在Hela细胞中检测地塞米松（DEX）对GR启动子活性的影响，在此基础上进一步检测CLA对DEX刺激后GR启动子的影响，同时本实验还检测了DEX对Plin1启动子活性的影响。结果显示，与对照组相比，饲喂CLA的小鼠的血浆中的cortisol含量显著下降(P<0.05），荧光定量PCR发现附睾脂肪组织中GR的mRNA表达水平显著下降(P<0.05）。荧光素酶报告基因系统检测发现，在转染GR启动子的Hela细胞中，DEX能使GR启动子的活性显著升高（P<0.05），但是CLA的添加则会抑制这种反应。在转染Plin1（含GRE）启动子的Hela细胞培养液中添加DEX则能显著增加Plin1（含GRE）启动子活性(P<0.01）。以上结果表明：CLA不仅能够使小鼠体内皮质醇（cortisol）含量下降，而且能使GR的表达下降；体外试验表明，CLA通过抑制GR启动子的活性进而抑制GR的表达，Dex能够增加Plin1启动子的活性。CLA通过抑制cortisol含量和GR的表达从而抑制GR靶基因Plin1的表达，从而导致脂肪组织异常脂解，最终引起脂肪减少。糖皮质激素（GC）通过糖皮质激素受体（GR）结合在动物的生理代谢过程中发挥着重要的作用。据报道，在同等的运输应激的条件下，二花脸和皮特兰猪的应激反应变现差异，二花脸猪并没有表现出明显的应激反应，皮特兰猪的应激反应比较强烈，通过检测两品种猪血清中的皮质醇（cortisol）含量发现，二花脸的cortisol含量显著高于皮特兰猪。另有报道，在基础代谢的条件下，二花脸猪血清中的cortisol含量也约是大白猪的2倍。两种不同的实验共同表明二花脸猪体内存在高皮质醇耐受的现象，GR信号的传导通路发生了障碍。因此，本实验的目的就是为了研究二花脸高皮质醇耐受产生的机制。首先本实验取4-5周龄的二花脸和大白猪，处死后取血制备血清检测cortisol的含量。P65作为NF-κB基因的亚基，在GR的信号通路中能够与GR竞争性的结合某种蛋白从而降低GR靶基因的表达。然后本实验取两品种猪的肝脏组织，用实时荧光定量PCR的方法检测GR基因及P65基因的信使核苷酸（mRNA）水平的表达差异性。为了进一步研究二花脸猪应激不敏感的机制，本实验克隆了GR下游的靶基因Plin1基因的启动子，该启动子上含有GRE序列，让这一启动子控制荧光素酶基因的表达，构建pGL3-pigPlin1（GRE）重组质粒，在Hela细胞中，转染该重组质粒，用地塞米松（DEX）刺激转染细胞，检测其荧光素酶报告基因的活性；共转染Plin1（GRE）启动子和P65，用Dex刺激转染细胞，检测荧光素酶报告基因的活性。结果显示：二花脸猪血清中的cortisol含量显著高于大白猪（P<0.05），前者约是后者的两倍；在mRNA水平上，二花脸猪的肝脏组织的GR基因和P65基因都显著高于大白猪。在体外试验中，荧光素酶报告系统显示，Dex刺激使GR靶基因启动子Plin1的活性升高，在Dex的刺激条件下，P65与GR靶基因启动子Plin1的共转染显著降低了GR靶基因的表达（P<0.05）。以上结果表明：二花脸猪的高皮质醇耐受现象象可能与P65基因的上调有关。

全文目录

致谢  4-8
第一部分糖皮质激素受体的学位论文">糖皮质激素受体通路在共轭亚油酸诱导的小鼠脂肪组织减少中的作用  8-38
  摘要  8-9
  1 文献综述  9-14
    1.1 共轭亚油酸的重要生理功能  9-10
      1.1.1 CLA 结构与来源  9-10
        1.1.1.1 CLA 的结构  9-10
        1.1.1.2 CLA 的来源  10
    1.2 CLA 对机体脂肪含量的影响  10-11
      1.2.1 CLA 能降低脂肪含量  10
      1.2.2 CLA 降低脂肪含量主要是由 t10c12 发挥作用  10
      1.2.3 CLA 对机体组成的影响  10-11
    1.3 CLA 摄入引起脂肪减少的发生机制  11-12
      1.3.1 CLA 能够使能量代谢作用和脂肪组织氧化增强  11
      1.3.2 CLA 能引起脂肪酸从头合成障碍和脂肪细胞凋亡加剧  11
      1.3.3 CLA 使围脂滴蛋白表达下降引起脂解作用增加  11-12
        1.3.3.1 脂滴的重要生理功能  11-12
        1.3.3.2 CLA 减少围脂滴蛋白表达  12
    1.4 糖皮质激素及其受体的作用机制  12-14
      1.4.1 糖皮质激素生理学功能  12-13
      1.4.2 糖皮质激素受体  13
      1.4.3 糖皮质激素( GC) 的作用机制  13-14
    1.5 GC，GR 与脂类代谢之间的关系  14
  2 引言  14-15
  3 材料与方法  15-23
    3.1 材料  15-16
      3.1.1 试验动物  15
      3.1.2 仪器  15-16
      3.1.3 试剂  16
    3.2 试验方法  16-23
      3.2.1 试验饲料的配制  16
      3.2.2 CLA/LA 小鼠体重脂肪组织重量的测定  16-17
      3.2.3 CLA/LA 小鼠血浆 cortisol 的检测  17
      3.2.4 Quantitative RT-PCR 对脂肪组织 GR 基因表达的检测  17-19
        3.2.4.1 样品总 RNA 的提取  17-18
        3.2.4.2 反转录合成 cDNA  18
        3.2.4.3 引物设计合成  18
        3.2.4.4 荧光定量 PCR  18
        3.2.4.5 mRNA 相对表达量的计算  18-19
      3.2.5 荧光素酶报告基因系统对 Plin1 启动子活性的检测  19-22
        3.2.5.1 质粒构建  19-21
        3.2.5.2 细胞培养  21
        3.2.5.3 CLA/LA 细胞培养液的配置  21-22
        3.2.5.4 重组质粒的真核瞬时转染及荧光素酶活性测定  22
      3.2.6 数据处理  22-23
  4 结果与分析  23-30
    4.1 CLA 对小鼠体重和脂肪组织重量的影响  23
    4.2 CLA 对小鼠血浆中 cortisol 的影响  23
    4.3 CLA 对小鼠附睾脂肪组织 GR 表达的影响  23
    4.4 CLA 对 GR 和 Plin1（GRE）启动子活性的影响  23-30
      4.4.1 GR 和 Plin1（GRE）启动子的克隆  23-24
      4.4.2 细胞培养  24
      4.4.3 Luciferase 活性的检测  24-30
  5 讨论  30-31
  6 结论  31-32
  参考文献  32-36
  ABSTRACT  36-38
第二部分糖皮质激素受体通路在二花脸猪高皮质醇耐受中的作用  38-51
  摘要  38-39
  1 文献综述  39-42
    1.1 应激及其主要危害  39
    1.2 应激反应过程中糖皮质激素的主要作用机制  39
    1.3 GR 与核转录因子 NF-KB 相互作用关系  39-41
    1.4 二花脸猪和大白猪的特性  41-42
  2 引言  42-43
  3 材料与方法  43-45
    3.1 实验动物  43
    3.2 试剂与仪器  43
    3.3 实验方法  43-45
      3.3.1 二花脸和大白猪血清中 cortisol 含量的检测  43
      3.3.2 荧光定量 PCR 对二花脸和大白猪肝脏组织的 GR 和 P65 基因表达的检测  43
      3.3.3 荧光素酶报告基因系统对 GR 启动子及 Plin1 启动子活性的检测  43-45
        3.3.3.1 Plin1 和 GR 基因启动子的克隆  43-44
        3.3.3.2 细胞培养  44
        3.3.3.3 pGL3-pig Plin1 重组质粒的真核瞬时转染及荧光素酶活性测定  44
        3.3.3.4 Luciferase 检测  44-45
  4 结果与分析  45-47
    4.1 不同品种猪的血清中皮质醇的变化  45
    4.2 肝脏组织中 GR 和 P65 的变化  45
    4.3 P65 对 GR 靶基因 Plin1 启动子活性的影响  45-47
  5 讨论  47-48
  6 结论  48
  参考文献  48-50
  ABSTRACT  50-51

糖皮质激素受体通路在共轭亚油酸诱导的小鼠脂肪组织减少以及二花脸猪高皮质醇耐受中的作用

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