学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

阿魏酸酯酶基因的获得和异源表达

作　者: 徐振上
导　师: 刘新利
学　校: 齐鲁工业大学
专　业: 轻工技术与工程
关键词: 阿魏酸酯酶 Burkholderia fungorum 基因组文库土曲霉异源表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

阿魏酸酯酶是一类水解酶，能够降解植物细胞壁中阿魏酸与木质素及阿拉伯半糖相交联的酯键。阿魏酸酯酶同其它纤维素酶如木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等具有协同作用，共同作用植物细胞壁时，能使其高效降解。利用阿魏酸酯酶，可以降低生产工艺中采用化学法所带来的环境问题，因此在造纸、纺织、饲料、食品等轻工行业具有广泛应用前景。阿魏酸酯酶作用底物产生的阿魏酸作为一种天然抗氧化剂，在食品、保健品和化妆品的应用中具有巨大潜力。本论文的研究目的是通过分子生物学方法，构建产阿魏酸酯酶工程菌株，提高阿魏酸酯酶的产量。具体研究内容和方法如下：本实验设计从两株出发菌中获得阿魏酸酯酶基因，首先利用本实验室前期筛选出一株产阿魏酸酯酶的细菌A216，本文中对其进行了形态学、生理生化以及分子生物学方面的鉴定，结果表明这是一株Burkholderia fungorum，实验中获得的16S rDNA序列和ITS序列，提交Genebank数据库分别获得注册码KJ026454和KJ130021。鉴于目前没有B. fungorum产生阿魏酸酯酶的研究报道，以及阿魏酸酯酶基因序列的不保守性，拟利用构建基因组文库的方法获得其阿魏酸酯酶编码基因。利用Sau3AⅠ部分酶切B. fungorum A216基因组DNA，回收300-4000bp片段。用BamHⅠ酶切载体pUC19，SAP去磷酸化，回收线性载体片段。将基因组片段与载体按摩尔比例10:1连接，转化DH5α感受态细胞，并将其涂布于含有阿魏酸乙酯的平板，对获得的基因组文库进行筛选。结果获得文库库容32000个克隆，插入率96％，平均插入片段2000bp，能够包含B. fungorum A216全部的基因组信息。但是通过这种透明圈筛选法，没有获得B. fungorum A216编码阿魏酸酯酶的序列。其次选择实验室前期筛选出的另一种阿魏酸酯酶产生菌土曲霉作为出发菌株，利用重叠拼接PCR方法获得了其编码阿魏酸酯酶的序列。为了开展下一步的异源表达实验，利用获得的土曲霉阿魏酸酯酶基因编码序列，分别在原核表达宿主大肠杆菌和真核表达宿主毕赤酵母中进行了异源表达。大肠杆菌异源表达中，利用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切阿魏酸酯酶的DNA和表达载体pET-22b(＋)，连接后成功构建了表达载体pET22b-fae，此表达载体成功转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化子发酵产物酶活测定结果显示阿魏酸酯酶成功表达，SDS-PAGE表明异源表达的阿魏酸酯酶大小为32kDa。在LB培养基中对此大肠杆菌转化子发酵条件进行了优化，结果在接种1％的种子液下，37℃培养4h后，添加IPTG终浓度至0.01mM，于30℃诱导9h后获得最高酶活420mU/mL，优化后产酶量为出发菌株土曲霉的28倍。以阿魏酸对硝基苯酚酯(4-NPF)为底物，大肠杆菌转化子产阿魏酸酯酶最适反应温度为50℃，温度稳定性为在60℃半衰期为6min，55℃半衰期为15min，50℃半衰期是4h，45℃半衰期为18h，温度低于40℃时有较好的稳定性，最适pH值为6.8，pH稳定性为在pH6-10的范围内保存24h后，酶活仍大于70％。在毕赤酵母异源表达过程中，利用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切阿魏酸酯酶的DNA和表达载体pPICZαA，连接后成功构建了表达载体pPICZαA-FAE，此表达载体经SacⅠ线性化后电转化感受态毕赤酵母GS115菌株，然后在含有博来霉素Zocin的平板上进行筛选，平板上长出的转化子经PCR验证，表明阿魏酸酯酶基因插入成功，然而SDS-PAGE实验和酶活测定实验均没有检测到目的蛋白的表达。其可能原因为转录RNA的空间结构阻碍了目的基因的翻译，下一步可以利用转化子通过RT-PCR方法进行分析检测。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第1章绪论  13-21
  1.1 阿魏酸酯酶简介  13-16
    1.1.1 分类与结构  13-14
    1.1.2 性质  14-15
    1.1.3 应用  15-16
  1.2 阿魏酸酯酶的产生菌  16-18
    1.2.1 原核生物  16-17
    1.2.2 真核生物  17-18
  1.3 阿魏酸酯酶异源表达体系  18-20
    1.3.1 原核表达体系  18-19
    1.3.2 真核表达体系  19-20
  1.4 论文研究立题背景和内容  20-21
第2章一株产阿魏酸酯酶细菌的鉴定  21-37
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 菌株  21
    2.1.2 培养基  21-22
    2.1.3 试剂  22-23
    2.1.4 仪器  23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 细菌 A216 的形态学鉴定  23-24
    2.2.2 生理生化鉴定  24-26
    2.2.3 分子生物学鉴定  26-28
  2.3 实验结果与分析  28-35
    2.3.1 形态学鉴定结果  28-29
    2.3.2 生理生化鉴定结果  29-31
    2.3.3 16S rDNA 序列分析  31-33
    2.3.4 ITS 序列分析  33-35
  2.4 本章小结  35-37
第3章 Burkholderia fungorum 基因组文库法筛选阿魏酸酯酶基因  37-47
  3.1 实验材料  37-38
    3.1.1 菌株  37
    3.1.2 培养基  37
    3.1.3 试剂  37-38
    3.1.4 仪器  38
  3.2 实验方法  38-41
    3.2.1 基因组 DNA 提取与检测  38-39
    3.2.2 Sau3AI 酶切基因组 DNA 浓度优化  39
    3.2.3 Sau3AI 酶切基因组 DNA 时间优化  39
    3.2.4 基因组 DNA 大量酶切  39-40
    3.2.5 BamHⅠ酶切 pUC19 载体和去磷酸化  40
    3.2.6 基因组文库的建立、筛选和鉴定  40-41
  3.3 实验结果与分析  41-45
    3.3.1 基因组 DNA 的提取与检测  41-42
    3.3.2 Sau3AI 对基因组 DNA 的部分酶切  42-43
    3.3.3 pUC19 载体的处理  43-44
    3.3.4 基因组文库筛选和评价  44-45
  3.4 本章总结  45-47
第4章土曲霉阿魏酸酯酶基因的获得及异源表达载体的构建  47-71
  4.1 实验材料  47-49
    4.1.1 菌株  47
    4.1.2 培养基  47
    4.1.3 试剂  47-48
    4.1.4 仪器  48-49
  4.2 实验方法  49-60
    4.2.1 克隆不含信号肽的土曲霉阿魏酸酯酶基因  49-54
    4.2.2 重叠拼接 PCR 技术去除土曲霉阿魏酸酯酶的内含子基因  54-57
    4.2.3 大肠杆菌表达载体 pET22b-fae 的构建  57-58
    4.2.4 毕赤酵母表达载体 pPICZαA-FAE 的构建  58-60
  4.3 实验结果与分析  60-70
    4.3.1 克隆不含信号肽的土曲霉阿魏酸酯酶基因  60-62
    4.3.2 重叠延伸 PCR 去除土曲霉阿魏酸酯酶的内含子基因  62-64
    4.3.3 表达载体 pET22b-fae 的构建  64-66
    4.3.4 表达载体 pPICZαA-FAE 的构建  66-70
  4.4 本章小结  70-71
第5章阿魏酸酯酶在大肠杆菌中的表达  71-87
  5.1 实验材料  71-74
    5.1.1 菌株  71
    5.1.2 培养基  71
    5.1.3 试剂  71-73
    5.1.4 仪器  73-74
  5.2 实验方法  74-78
    5.2.1 质粒 pET22b-fae 转化大肠杆菌 BL21(DE3)  74
    5.2.2 大肠杆菌转化子的发酵  74-76
    5.2.3 大肠杆菌转化子在 LB 培养基中发酵条件的优化  76-77
    5.2.4 阿魏酸酯酶性质研究  77-78
  5.3 实验结果与分析  78-85
    5.3.1 大肠杆菌转化子的鉴定  78
    5.3.2 大肠杆菌转化子初步发酵的酶活和 SDS-PAGA 电泳  78-80
    5.3.3 大肠杆菌转化子在 LB 培养基中发酵条件的优化  80-82
    5.3.4 阿魏酸酯酶性质研究  82-85
  5.4 本章小结  85-87
第6章阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的表达  87-95
  6.1 实验材料  87-88
    6.1.1 菌株  87
    6.1.2 培养基  87
    6.1.3 试剂  87-88
    6.1.4 仪器  88
  6.2 实验方法  88-91
    6.2.1 质粒 pPICZαA-FAE 的线性化  88-89
    6.2.2 毕赤酵母 GS115 感受态细胞制备  89
    6.2.3 毕赤酵母电转化  89-90
    6.2.4 毕赤酵母转化子的的鉴定  90
    6.2.5 毕赤酵母转化子的发酵  90-91
  6.3 实验结果与分析  91-93
    6.3.1 表达载体 pPICZαA-FAE 的线性化  91
    6.3.2 电转化结果  91-92
    6.3.3 毕赤酵母转化子的鉴定  92
    6.3.4 毕赤酵母转化子发酵的酶活和 SDS-PAGA 电泳  92-93
  6.4 本章小结  93-95
全文总结与展望  95-97
参考文献  97-103
致谢  103-105
在学期间主要科研成果  105

阿魏酸酯酶基因的获得和异源表达

内容摘要

全文目录

相似论文