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GIT2与TRAF1协同抑制NF-κB信号通路的分子机制

作　者: 刘博雅
导　师: 贺福初
学　校: 北京工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: GIT2 TRAF1 NF-κB
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


核因子κB（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）是一类具有多向转录调节作用的转录因子，调节免疫和炎症反应，在很多生物学过程中发挥重要作用，如先天免疫、适应性免疫、胚胎发育和肿瘤形成等。NF-κB调控百余种基因的表达，参与细胞生长、分化和发育。NF-κB信号通路分为经典NF-κB信号通路和非经典的NF-κB信号通路，其主要区别为是否依赖于NEMO参与NF-κB信号通路。在经典NF-κB信号通路中，不同的刺激因子下，依赖于不同的TRAF蛋白调控下游通路。TRAF（TNFreceptor-associatedfactor）家族是一类结构相似的支架蛋白，一共包含7个蛋白，它们介导肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员引起的细胞凋亡。TRAF1由于可以和TNFR2相互作用而被发现，其结构分为TRAF-N端及高度保守的TRAF-C端，TRAF1和其它的TRAF家族成员不同，它缺乏N端的RING锌指结构，不具有泛素连接酶活性。TRAF1的主要功能为调控T细胞受体介导的细胞凋亡。近年来，GWAS研究显示,TRAF1与多种免疫性疾病具有相关性，包括系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等。GIT2(GPCR-kinaseinteractingproteins2)在很多组织中广泛分布。它参与多种细胞生理过程，包括调控细胞骨架动态变化、受体内吞、调控多种信号分子的激活。git2基因敲除小鼠表现出骨髓外造血、脾肿大、髓性粒细胞增加、肺部淋巴细胞浸润增加、对病原体感染的敏感性增加等多个免疫缺陷症状，提示GIT2在免疫调控方面发挥重要作用。然而，迄今为止没有文献报道GIT2对NF-κB信号通路有直接调控作用。我们前期通过酵母双杂交技术，以GIT2为诱饵，筛选到包括TRAF1、A20、NEMO在内的6种与NF-κB信号通路相关的蛋白，提示GIT2可能在NF-κB信号通路中发挥调控作用。我们应用免疫共沉淀的方法确定了GIT2与TRAF1的相互作用，以及TRAF1和GIT2相互作用区域。接着用报告基因的技术，在HEK293细胞中过表达GIT2蛋白及TRAF1蛋白，确定GIT2与TRAF1抑制NF-κB信号通路。并且发现TRAF1截短体不能与GIT2协同抑制NF-κB信号通路，GIT2对NF-κB信号通路的影响不依赖于其Arf-GAP活性。同时，我们发现GIT2对TRAF1、TRAF2结合几乎没有影响，但是GIT2能抑制TRAF1与TRAF6结合，并且GIT2和TRAF1共同负调控TRAF2及TRAF6的泛素化。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
英文缩略词  8-10
第1章 绪论  10-16
  1.1 NF-κB信号通路  10-11
  1.2 TRAF1（肿瘤坏死因子受体结合分子1）  11-13
  1.3 GIT2（G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2）  13-15
  1.4 本研究的目的与意义  15-16
第2章 GIT2与TRAF1相互作用  16-24
  2.1 实验材料  16-18
    2.1.1 细胞  16
    2.1.2 质粒  16
    2.1.3 实验试剂  16-17
    2.1.4 溶液的配置  17-18
  2.2 实验方法  18-19
    2.2.1 免疫共沉淀实验  18-19
    2.2.2 Westernblot实验  19
  2.3 实验结果  19-21
  2.4 讨论  21-22
  2.5 本章小结  22-24
第3章 GIT2与TRAF1协同抑制NF-κB信号通路  24-34
  3.1 实验材料  24-25
    3.1.1 细胞  24
    3.1.2 质粒  24
    3.1.3 实验试剂  24-25
  3.2 实验方法  25-26
    3.2.1 细胞转染  25
    3.2.2 双荧光素酶报告基因检测  25
    3.2.3 WesternBlot  25
    3.2.4 构建GIT2R39K及GIT2ARF-GAPR39K突变体  25-26
  3.3 实验结果  26-31
    3.3.1 GIT2与TRAF1协同负调控NF-κB信号通路  26-28
    3.3.2 TRAF1截断体对NF-κB信号通路没有影响  28
    3.3.3 GIT2负调控NF-κB信号通路不依赖其Arf-GAP活性  28-30
    3.3.4 TNF-α及IL-1β不影响GIT2与TRAF1的结合  30-31
  3.4 讨论  31-32
  3.5 本章小结  32-34
第4章 GIT2与TRAF1抑制NF-κB通路中TRAF2和TRAF6分子的泛素化..25  34-40
  4.1 实验材料  34-35
    4.1.1 细胞  34
    4.1.2 质粒  34
    4.1.3 实验试剂  34-35
  4.2 实验方法  35
    4.2.1 细胞转染  35
    4.2.2 免疫共沉淀实验  35
    4.2.3 Westernblot实验  35
    4.2.4 体内泛素化实验  35
  4.3 实验结果  35-37
    4.3.1 GIT2抑制TRAF1/TRAF6的结合，但不影响TRAF1/TRAF2的结合  35-36
    4.3.2 GIT2与TRAF1协同影响TRAF2及TRAF6的泛素化  36-37
  4.4 讨论  37-38
  4.5 本章小结  38-40
结论  40-44
参考文献  44-50
附录  50-58
攻读硕士学位期间所发表的学术论文  58-60
致谢  60

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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