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构巢曲霉胞质分裂SIN途径反向调节基因的研究

作　者: 仲国维
导　师: 陆玲
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 构巢曲霉胞质分裂 SIN SEPH 反向调节基因 PP2A
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

细胞分裂(cell division)过程是真菌(fungi)进行无性繁殖的重要方式,对于真菌的形态建成是必需的。细胞分裂一旦失调将会导致真菌的生长受损甚至死亡。研究这个过程的发生机制,对于控制医学和农业上有害真菌的增殖或促进工业上有益真菌的生长都具有非常重要的意义。真菌的胞质分裂(cytokinesis)的发生是由母细胞通过收缩肌动蛋白环从而分裂其细胞质,最终产生两个子细胞的过程。胞质分裂是有丝分裂细胞核分裂之后的最后也是最关键的一步。无数的研究表明,该过程需要一个非常保守的信号网络的激活,这个信号网络在芽殖酵母中称为有丝分裂退出网络(Mitotic Exit Network, MEN),在裂殖酵母中称为隔膜形成网络(Septum Initiation Network SIN)。虽然不同的真菌会有不同的机制来完成胞质分裂的过程,但在哺乳动物及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等真菌中的研究已有越来越多证据表明这个网具有一定的保守性。‘与单细胞的酵母不同,丝状真菌构巢曲霉的菌丝是由隔膜所间隔的多核细胞。在构巢曲霉的孢子萌发过程中,分生孢子首先经过多轮的核分裂生成8到16个核,但是直到细胞达到一定的体积后才会产生隔膜,第一个隔膜通常在孢子头和芽管的分隔处生成。因此,菌丝中的胞质分裂和有丝分裂不是同步进行的。在构巢曲霉中SIN途径的SEPH蛋白是由温度敏感型菌株筛选实验发现的,是裂殖酵母SIN信号途径中的丝-苏氨酸激酶Cdc7p的同源蛋白,它是胞质分裂早期所必须的组分。但是目前关于SEPH的调节元件是否存在,以及它们是正向调控还是反向调控SEPH知道的很少。为了对这一机制进行研究,前期实验中我们通过紫外诱变获得了116株能够恢复sepH缺陷的突变菌。通过杂交分离、回交验证、互补实验(complementation test)并测序得到了反向调节基因(suppressor)磷酸核糖焦磷酸合成酶Anprs1(AN6711.4, Phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP synthetase)。本课题首先对该基因单独设计引物扩增并连接入质粒Prg3-AMA1-Not I,再次进行互补实验转入菌株Sinl10仍旧得到了和前期相同的结果。这说明Sin110的病态表型确实是由Anprs1基因造成的。进一步通过反向遗传学验证Anprs1基因是sepH的反向调节子,我们构建了乙醇启动子控制的GFP标记的Anprs1同源整合菌株、透射电镜观察、Anprs1完全敲除和C端部分敲除等验证了Anprs1的功能,又通过PRS酶活测定、qRT-PCR技术、酵母双杂交技术验证了Anprs1,2,3家族蛋白的功能。结果显示AnPRS1蛋白弥散定位在胞质中,在正在形成的隔膜上有微弱的聚集信号,推测其在胞质近隔膜的位置参与隔膜形成。抑制表达情况下和Sin110菌株表型一致,电镜结果显示Anprs1基因受到抑制时隔膜呈弯曲状。Anprs1完全敲除菌表型和野生型一致,但是C端敲除菌表型和Sin110菌株一致。AnPRS酶活测定显示Sin110菌株中酶活最低,显示了正常的胞质分裂和PRS酶活相关。但Anprs1,2,3基因测序都没有突变,我们推测酶活的降低可能和这三个基因的转录有关,Sin110菌株的qRT-PCR的结果显示Anprs1,Anprs2和Anprs3都明显表达下调,把这三个基因全部克隆入载体Prg3-AMA1-Not Ⅰ,共转入Sin110菌株,结果其病态表型被完全弥补。进一步的酵母双杂交实验表明构巢曲霉中存在AnPRS家族形成三聚体发挥功能。另外根据酵母中对蛋白磷酸酶2A(protein phosphatases2A, PP2A)调节亚基能够反向调节SIN的发现及其和AnPRS家族都能转移磷酸基团的功能。我们找到并研究了构巢曲霉中PP2A的两个调节亚基parA和pabA,虽然不能反向调节sepH,但对于构巢曲霉的形态建成起重要作用。本课题对于构巢曲霉胞质分裂的研究,将为我们在实际应用中抑制或促进真菌的无性繁殖提供重要的理论基础,对医学上控制肿瘤治疗提供强有力的理论依据。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-13
第1章绪论  13-40
  1 真菌中胞质分裂的研究进展  13-27
    1.1 真核生物胞质分裂的一般特点  13-14
    1.2 真菌胞质分裂的一般特点  14-17
      1.2.1 概述  14
      1.2.2 胞质分裂信号通路  14
      1.2.3 Septin环  14-15
      1.2.4 Actin环  15-16
      1.2.5 细胞壁物质  16-17
    1.3 芽殖酵母的胞质分裂机制  17-19
    1.4 裂殖酵母的胞质分裂机制  19-23
    1.5 丝状真菌构巢曲霉胞质分裂研究进展  23-27
      1.5.1 模式生物构巢曲霉及其胞质分裂信号通路  23-24
      1.5.2 SEPH激酶的结构和功能  24-25
      1.5.3 胞质分裂信号通路的反向调节研究  25-26
      1.5.4 胞质分裂研究前景  26-27
  2 丝状真菌无性产孢的研究进展  27-30
    2.1 概述  27-30
    2.2 无性产孢和胞质分裂的关系  30
  3 真菌极性生长的研究进展  30-33
    3.1 概述  30-31
    3.2 极性生长的建立和维持  31-33
    3.3 极性生长和胞质分裂的关系  33
  4 模式生物构巢曲霉的特点  33-36
  5 研究内容、思路和方法  36-40
    5.1 研究内容  36-37
    5.2 研究思路  37-38
    5.3 研究方法  38-40
      5.3.1 正向筛选出sepH的反向调节子Anprs1  38
      5.3.2 反向验证Anprs1是sepH的反向调节子  38-39
      5.3.3 构巢曲霉中PP2A参与形态建成  39-40
第2章 sepH反向调节子Anprs1的筛选和初步验证  40-55
  第1节 sepH反向调节子Anprs1的筛选  42-49
    1 材料与方法  42-44
      1.1 菌种及培养条件  42-43
      1.2 试剂与仪器  43
      1.3 紫外诱变  43
      1.4 遗传杂交  43-44
      1.5 Actin免疫荧光染色  44
      1.6 显微观察  44
    2 实验结果  44-48
    3 讨论  48-49
  第2节 sepH反向调节子Anprs1的初步验证  49-55
    1 材料与方法  49-52
      1.1 菌种及培养条件  49-50
      1.2 试剂与仪器  50
      1.3 构巢曲霉基因组DNA的提取  50-51
      1.4 引物设计  51
      1.5 PCR扩增Anprs1全长和pAMA1-Anprs1质粒的构建  51
      1.6 A. nidulans原生质体的制备及转化  51-52
      1.7 转化子的筛选  52
    2 实验结果  52-54
      2.1 PCR扩增结果  52-53
      2.2 重组载体酶切验证  53
      2.3 转化子表型鉴定  53-54
    3 讨论  54-55
第3章利用乙醇脱氢酶启动子alcA(p)替换Anprs1启动子和绿色荧光蛋白GFP标记Anprs1  55-68
  第1节 alcA(p)：：GFP：：Anprs1同源整合菌株ZGA01构建  56-62
    1 材料与方法  56-58
      1.1 菌种及培养条件  56
      1.2 试剂与仪器  56-57
      1.3 引物设计  57
      1.4 pLB-Anprs1 5’载体的构建  57
      1.5 转化子的初步筛选  57
      1.6 重组子的进一步鉴定  57-58
    2 实验结果  58-61
      2.1 PCR扩增结果  58-59
      2.2 重组载体的酶切鉴定  59
      2.3 转化子的初步表型鉴定  59-60
      2.4 重组子的进一步PCR鉴定  60-61
    3 讨论  61-62
  第2节 Anprs1在构巢曲霉胞质分裂过程中的生物学功能  62-68
    1 材料与方法  63-65
      1.1 菌种及培养条件  63
      1.2 试剂与仪器  63-64
      1.3 透射电子显微镜(TEM)样品制备  64-65
    2 实验结果  65-67
      2.1 ZGAO1胞质分裂异常表型和Sin110比较  65-66
      2.2 GFP-AnPRS1的荧光定位  66
      2.3 TEM电镜观察隔膜结果  66-67
    3 讨论  67-68
第4章构巢曲霉Anprs1敲除菌株的构建  68-82
  第1节 Anprs1完全敲除菌株ZGA02的构建  68-77
    1 材料与方法  68-73
      1.1 菌种、质粒及培养条件  68-69
      1.2 试剂与仪器  69
      1.3 引物设计  69-71
      1.4 Fusion PCR  71-72
      1.5 构巢曲霉原生质体的制备及转化  72
      1.6 转化子的初步筛选  72
      1.7 转化子的进一步PCR诊断  72-73
    2 实验结果  73-76
      2.1 Fusion PCR各组成片段的扩增  73-74
      2.2 Fusion PCR全长片段的扩增  74
      2.3 转化子的初步鉴定  74-75
      2.4 转化子的诊断PCR  75
      2.5 ZGA02胞质分裂形态鉴定  75-76
    3 讨论  76-77
  第2节 Anprs1 C端敲除菌株ZGA03的构建  77-82
    1 材料与方法  77-79
      1.1 菌种、质粒及培养条件  77
      1.2 引物设计  77-78
      1.3 转化子的PCR诊断  78-79
    2 实验结果  79-80
      2.1 Fusion PCR全长片段的扩增  79
      2.2 转化子的诊断PCR  79-80
      2.3 ZGA03胞质分裂形态鉴定  80
    3 讨论  80-82
第5章 Anprs家族在构巢曲霉胞质分裂过程中的作用  82-91
  1 材料与方法  82-85
    1.1 菌种及培养条件  82
    1.2 试剂与仪器  82
    1.3 Sin110菌株Anprs基因测序  82-83
    1.4 AnPRS酶活测定  83
    1.5 Real-time qPCR实验方法  83-85
  2 实验结果  85-89
    2.1 Anprs1△C/sepH双缺菌株ZGA04的表型鉴定  85-87
    2.2 Sin110菌株AnPRS酶活测定结果  87-88
    2.3 Sin110菌株Anprs基因家族转录水平变化  88
    2.4 Anprs基因家族能够弥补Sin110的病态表型  88-89
  3 讨论  89-91
第6章 PP2A在构巢曲霉胞质分裂过程中的生物学功能  91-106
  第1节 PP2A参与构巢曲霉的形态建成  93-101
    1 材料与方法  93-94
    2 实验结果  94-100
      2.1 构巢曲霉PP2A两个调节亚基的生物信息学分析  94-96
      2.2 parA和pabA影响无性产孢和有性生殖  96-99
      2.3 parA和pabA分别与sepH和sepA在调节胞质分裂中的关系  99-100
    3 讨论  100-101
  第2节 PP2A在细胞中的定位  101-106
    1 材料与方法  101
    2 实验结果  101-104
      2.1 alcA(p)：：GFP：：parA和alcA(p)：：GFP：：pabA菌株的构建  101-102
      2.2 GFP-ParA和GFP-PabA分别定位在隔膜和细胞核上  102-104
    3 讨论  104-106
第7章结论  106-108
附录  108-109
参考文献  109-120
致谢  120

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