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菊苣DREB1家族基因的分离和表达分析及其遗传转化体系的建立

作　者: 陈丹丹
导　师: 郑青松；梁明祥
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋科学
关键词: 菊苣 DREB转录因子亚细胞定位酵母单杂遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究从菊苣中分离克隆了逆境胁迫诱导的两个DREB1转录因子-CiDREB1A和CiDREB1B,并进一步研究了全生育期非逆境胁迫下的CiDREB1A和CiDREB1B的时空表达模式以及逆境胁迫条件下菊苣CiDREB1A和CiDREB1B的诱导表达模式；然后通过亚细胞定位表达系统和酵母单杂交表达系统初步验证了这两个转录因子的功能;同时研究了培养基和激素的不同配比对普那菊苣离体再生影响的研究,建立起了普那菊苣稳定高效的离体再生体系。本研究为深入探索菊苣的抗逆机理提供了参考依据,为进一步发掘菊苣抗逆基因和菊苣的品种改良奠定了工作基础。主要研究结果如下：1.通过生物信息学中的电子克隆技术,利用其它物种已有的DREB1的编码序列到菊苣EST数据库进行比对,通过将筛选到的EST序列进行拼接,获得了两条包含ORF全长的EST序列并设计特异引物,从菊苣中克隆得到两个可能的转录因子CiDREB1A和CiDREB1B,登录号分别为：KC801338釉KC811151。这两个转录因子的ORF全长分别为699bp和669bp,分别编码232和222个氨基酸。同源序列比对表明,克隆得到的菊苣的CiDREB1A和CiDREB1B具有一个保守的AP2/EREBP结构域和核定位信号NLS,并且与经过功能验证的菊花中的DgDREB1A和DgDREB1B基因具有很高的相似性。全生育期非逆境胁迫下的时空表达模式分析表明CiDREB1A和CiDREB1B只有在菊苣生长的幼苗时期有相对高的表达量,之后表达量逐渐下降。逆境胁迫下的CiDREB1A和CiDREB1B在转录水平上的相对表达量变化表明,这两个基因在6h受4℃低温的强烈诱导,但同时它们的相对表达量也受干旱的轻微诱导；这表明CiDREB1A和CiDREB1B主要参与菊苣低温逆境胁迫诱导下的转录调控。2.构建的CiDREB1A-GFP和CiDREB1B-GFP融合蛋白表达载体通过基因枪法已经成功转入洋葱表皮细胞,然后利用共聚焦显微镜观察,确定CiDREB1A和CiDREB1B确实是定位在细胞核里,说明这两个转录因子是核蛋白。酵母单杂交试验表明只有转化进去pGADT7-AD-CiDREB1A、pGADT7-AD-CiDREB1B的酵母菌株,才能够在含有10mmol/L3-AT的SD/-His勺筛选培养基上生长。这表明CiDREB1A和CiDREB1B转录因子的AP2/EREBP结构域具有和DRE顺式作用元件特异性结合的能力,初步证实了CiDREB1A和CiDREB1B具有DREB转录因子的功能。3.通过对培养基和激素的不同配比对普那菊苣离体再生频率影响的研究,建立起了普那菊苣的离体高效再生体系。普那菊苣叶片在MS基本培养中添加了1.5mg/L6-BA和0.2mg/L IBA的激素组合,能得到最佳的愈伤诱导率和芽分化率；分化芽在添加了0.1mg/L的NAA的1/2MS培养基中,能得到最佳的生根率。初步建立了农杆菌介导A1NHX1基因转化普那菊苣叶片的遗传转化体系,从而验证了农杆菌介导普那菊苣叶片转化的适宜条件为：预培养时间为3d,农杆菌悬浮液的OD600值为0.6,侵染时间为5min,脱菌筛选培养基加入500mg/L的羧苄青霉素(Carb)和20mg/L(?)卡那霉素(Kan),共培养基中添力100μmol/L的乙酞丁香酮,共培养时间为3d。对获得的普那抗性植株进行了PCR检测,表明部分普那抗性植株含有外源目的基因,统计获得普那菊苣转化效率为10%,从而证明AlNHX1基因已经成功转入普那菊苣基因组中。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词  10-11
第一章文献综述  11-25
  1 低温胁迫对植物造成的影响  11-13
    1.1 低温胁迫对植物造成的伤害  11-12
    1.2 植物抗寒的分子机理  12-13
  2 DREB转录因子  13-18
    2.1 转录因子的概念  14
    2.2 转录因子的结构  14
    2.3 植物中的DREB类转录因子  14-18
  3 普纳菊苣高效遗传转化体系主要影响因素  18-20
    3.1 品种基因型  18-19
    3.2 外植体的种类和年龄  19
    3.3 外植体的大小  19
    3.4 基本培养基  19
    3.5 激素  19-20
  4 普那菊苣研究概况  20-22
    4.1 普那菊苣的介绍  20-21
    4.2 普那菊苘的研究概况  21-22
  5 本论文的研究目的意义和技术路线  22-25
    5.1 目的意义  22-23
    5.2 技术路线  23-25
第二章菊苣中CiDREB1家族基因的分离及诱导和时空表达模式分析  25-43
  1 引言  25
  2 材料与方法  25-32
    2.1 材料  25-26
    2.2 方法  26-32
  3 结果与分析  32-42
    3.1 菊苣中CiDREB1s的cDNA序列的克隆  32-34
    3.2 菊苣中CiDREB1s的保守区分析  34-36
    3.3 CiDREB1s与其它物种DREB家族转录因子的进化树分析  36-38
    3.4 CiDREB1s基因的表达模式分析  38-42
  4 讨论  42-43
第三章菊苣CiDREB1A和CiDREB1B的亚细胞定位及转录功能研究  43-63
  1 引言  43
  2 材料与方法  43-52
    2.1 材料  43-45
    2.2 方法  45-52
  3 结果与分析  52-60
    3.1 菊苣CiDREB1s基因亚细胞定位的分析  52-55
    3.2 通过酵母单杂交系统对菊苣CiDREB1s基因的DNA结合活性研究  55-60
  4 讨论  60-63
第四章普那菊苣离体再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化体系的研究  63-73
  1 引言  63
  2 材料与方法  63-67
    2.1 材料  63-65
    2.2 方法  65-67
  3 结果与分析  67-70
    3.1 普那菊苣离体再生体系的最佳再生培养基的筛选  67-70
    3.2 普那菊苣高效遗传转化体系的建立  70
  4 讨论  70-73
全文总结  73-75
创新点  75-77
展望  77-79
参考文献  79-87
攻读硕士学位期间发表、待发表和已投论文  87-89
附录一  89-91
附录二  91-93
致谢  93

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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