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盐地碱蓬种子萌发过程中耐盐生理指标测定及基因表达分析

作　者: 代莉慧
导　师: 贾晋
学　校: 内蒙古科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 盐胁迫种子萌发生理指标 cDNA-AFLP 盐地碱蓬
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

盐地碱蓬（Suaeda salsa）为黎科碱蓬属一年生草本盐生植物，具有与耐盐相关的典型形态结构特征，例如叶片肉质化等。土壤中含有一定量的Na⁺和Cl^-、SO₄^2-或CO₃^2-对其生长有促进作用。种子萌发是植物生命周期中的重要事件，也是植物最易受到环境影响的发育阶段。本文以采自内蒙古河套灌区重度盐渍区的盐地碱蓬种子为材料，探讨了Na₂CO₃（碱性盐）和NaCl（中性盐）胁迫对盐地碱蓬种子萌发特性和生理指标的影响，分析了100mmol/L NaCl （盐地碱蓬种子萌发适应NaCl的极限值）胁迫下，盐地碱蓬种子萌发过程中基因表达谱的变化，研究内容如下：1、分析了不同性质盐胁迫对盐地碱蓬种子萌发特性的影响。结果发现随盐浓度的升高，种子萌发率呈下降趋势，萌发率与盐浓度间呈现显著的负相关关系；其中未胁迫（蒸馏水处理）时，盐地碱蓬种子萌发率最高，盐地碱蓬种子萌发率与NaCl、Na₂CO₃胁迫的相关系数分别为0.9206和0.9148；Na₂CO₃对种子萌发的抑制作用强于NaCl。其中，盐地碱蓬种子萌发适应NaCl浓度的极限值为100mmol/L。2、分析了不同性质盐胁迫后盐地碱蓬种子萌发过程中耐盐相关生理指标的变化趋势。结果发现100mmol/L NaCl和Na₂CO₃胁迫0、12、24、36、48及60h后可溶性蛋白含量变化趋势较为平缓，SOD酶活性呈“先降后升再降”的变化趋势，POD、MDA、可溶性糖和游离脯氨酸含量均呈上升趋势。生理指标的研究结果进一步证实盐地碱蓬种子萌发对NaCl胁迫的耐受能力强于Na₂CO₃胁迫。3、采用cDNA-AFLP技术分析了100mmol/L NaCl胁迫0、12、24、36、48和60h的盐地碱蓬种子萌发中基因的表达情况。采用256对引物扩增后获得851个差异表达条带，片段长度分布于100-1000bp之间。根据基因表达情况不同，将差异条带分为“强→弱（384个，占45.1%）”、“弱→强（233个，占27.4%）”、“强→弱→强（15个，占1.8%）”、“弱→强→弱（82个，占21.4%）”及“瞬间表达（37个，占4.3%）”5种类型。4、随机选取113条差异表达条带，对其进行回收、克隆、测序后，经BLASTX同源比对分析发现，其中30%TDFs（Transcript derived fragments）与NCBI数据库中功能已知的蛋白质同源，基于同源蛋白质的功能，这些TDFs被分为“光合作用与能量代谢”（占3%）、“信号转导”（占3%）、“新陈代谢”（占10%）、“物质转运”（占1%）、“基因的转录和翻译”（占1%）及“逆境防御”（占12%）等6种类型；28%的TDFs序列与功能未知蛋白质同源；42%的TDFs在GenBank数据库中未发现同源序列。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
引言  11-12
1 文献综述  12-23
  1.1 盐胁迫对植物的伤害  12
  1.2 植物耐盐机制  12-14
    1.2.1 渗透调节作用  12-13
    1.2.2 离子区隔化作用  13
    1.2.3 代谢途径的改变  13
    1.2.4 离子的选择性吸收和拒盐  13
    1.2.5 抗氧化保护酶类活性的改变  13-14
  1.3 植物耐盐分子机制  14-16
    1.3.1 渗透胁迫相关基因  14-15
    1.3.2 离子胁迫相关基因  15
    1.3.3 活性氧清除酶基因  15-16
    1.3.4 盐地碱蓬抗逆相关基因的研究进展  16
  1.4 盐胁迫对种子萌发的影响  16-18
    1.4.1 盐胁迫影响种子发芽率  16-17
    1.4.2 盐胁迫影响种子发芽势  17
    1.4.3 盐胁迫影响发芽指数  17
    1.4.4 植物种子萌发的适盐范围  17-18
  1.5 盐胁迫下种子萌发中生化指标的变化  18-20
    1.5.1 渗透调节物质  18-19
    1.5.2 氧自由基清除酶系统  19-20
  1.6 cDNA-AFLP 技术  20-22
    1.6.1 流程  20-21
    1.6.2 特点  21-22
  1.7 本研究的意义  22
  1.8 技术路线  22-23
2 不同盐胁迫对盐地碱蓬种子萌发的影响  23-27
  2.1 实验材料、试剂与仪器  23
    2.1.1 实验材料  23
    2.1.2 实验试剂  23
    2.1.3 仪器  23
  2.2 实验方法  23
  2.3 数据处理  23-24
  2.4 结果分析及讨论  24-27
    2.4.1 不同浓度盐胁迫对盐地碱蓬种子萌发率的影响  24-25
    2.4.2 不同浓度盐胁迫对盐地碱蓬种子萌发进程的影响  25
    2.4.3 不同盐胁迫对盐地碱蓬种子萌发率的相关性回归分析  25-27
3 不同盐胁迫对盐地碱蓬种子萌发过程中生理指标的影响  27-40
  3.1 实验材料、试剂与仪器  27-28
    3.1.1 材料与方法  27
    3.1.2 试剂  27
    3.1.3 仪器  27-28
  3.2 实验方法  28-33
    3.2.1 超氧化物歧化酶活性测定  28-29
    3.2.2 过氧化物酶活性测定  29
    3.2.3 丙二醛含量测定  29-30
    3.2.4 可溶性糖含量测定  30-31
    3.2.5 可溶性蛋白含量测定  31-32
    3.2.6 游离脯氨酸含量测定  32-33
  3.3 结果与分析  33-39
    3.3.1 盐胁迫下对盐地碱蓬种子萌发过程中抗氧化保护酶类的影响  33-35
    3.3.2 盐胁迫下对盐地碱蓬种子萌发过程中渗透调节物质的影响  35-39
  3.4 结果与讨论  39-40
4 盐地碱蓬种子萌发中耐盐相关基因差异表达分析  40-59
  4.1 实验材料、试剂与仪器  40-41
    4.1.1 实验材料  40
    4.1.2 试剂  40-41
    4.1.3 仪器  41
  4.2 实验方法  41-49
    4.2.1 RNA 的提取  41-42
    4.2.2 RNA 纯化  42
    4.2.3 cDNA 一链合成  42-43
    4.2.4 cDNA 二链合成  43-44
    4.2.5 cDNA 的精制  44
    4.2.6 酶切  44
    4.2.7 接头连接  44-45
    4.2.8 预扩增  45
    4.2.9 选择性扩增  45-46
    4.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳  46-47
    4.2.11 差异表达片段的聚丙烯酰胺胶回收与二次 PCR 扩增  47
    4.2.12 二次 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶回收  47
    4.2.13 回收产物的克隆  47-48
    4.2.14 热激转化  48-49
    4.2.15 差异 cDNA 片段测序及序列分析  49
  4.3 结果与分析  49-59
    4.3.1 RNA 的提取质量  49-51
    4.3.2 cDNA 一链的合成  51
    4.3.3 cDNA 二链的合成  51-52
    4.3.4 预扩增  52-53
    4.3.5 NaCl 极限值胁迫下分离差异表达条带  53-54
    4.3.6 菌落 PCR  54-55
    4.3.7 差异条带测序结果的 BLAST 分析  55-57
    4.3.8 部分差异表达条带同源性分析  57-59
结论  59-60
参考文献  60-71
在校研究成果  71-72
致谢  72

盐地碱蓬种子萌发过程中耐盐生理指标测定及基因表达分析

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