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水稻osvdac基因RNAi载体的构建及其在转基因植株中的表达分析

作　者: 郭文静
导　师: 王春台
学　校: 中南民族大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻电压依赖性阴离子通道 osvdac基因 RNA干涉
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)广泛存在于真菌、植物和动物中。VDAC主要在调节线粒体与细胞质之间物质运输和能量调节以及在线粒体介导的细胞凋亡中具有重要作用。在水稻基因组中，已发现至少有8个编码VDAC的基因。本研究采用酶切酶连方法针对其中5个水稻osvdac基因(osvdac4、osvdac5、osvdac6、osvdac7和osvdac8)构建RNA干涉表达载体，其中osvdac4和osvdac7干涉表达载体成功转化水稻品种日本晴，获得了转基因阳性植株。以osvdac7基因下调的转化植株为材料，利用荧光定量PCR分析技术，研究了osvdac7基因下调条件下，其它osvdac家族成员的表达水平变化。主要结果如下：1.以pMCG161构建了5个水稻osvdac基因的9个RNA干涉表达载体，即osvdac4-5、osvdac4-3、osvdac5-5、osvdac5-3、osvdac6-3、osvdac7-5、osvdac7-3、osvdac8-5和osvdac8-3。2.用9个RNA干涉表达载体分别转化水稻品种日本晴，只有osvdac4-3、osvdac7-5和osvdac7-3的遗传转化成功获得了阳性转基因植株。荧光定量PCR分析表明，其被干涉的相应基因均有不同程度的下调表达趋势。3.采用实时荧光定量PCR，分析了osvdac7基因下调的RNA干涉植株中8个osvdac基因表达水平的变化。结果显示，osvdac7基因的干涉下调与osvdac3有平行下调表达的趋势，除osvdac6的表达水平有一定的上调趋势外，其它vdac家族成员变化不明显。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
第一章文献综述  9-23
  1.1 VDAC 蛋白  9-19
    1.1.1 VDAC 的结构  9-12
    1.1.2 VDAC 的定位  12-14
    1.1.3 VDAC 沉默对细胞的影响  14-17
    1.1.4 植物 VDAC  17-19
  1.2 RNAi 技术  19-22
    1.2.1 RNA 干扰的发现  19-20
    1.2.2 RNA 干扰的分子作用机制  20-21
    1.2.3 RNA 干扰的特点  21
    1.2.4 RNAi 在植物中的应用  21-22
  1.3 本研究的主要内容、目的及意义  22-23
第二章 5 个 osvdac 基因 RNAi 表达载体的构建  23-39
  2.1 前言  23-24
  2.2 材料和试剂  24
    2.2.1 试验材料  24
    2.2.2 试验试剂  24
  2.3 实验方法  24-32
    2.3.1 RNAi 引物的设计  24-25
    2.3.2 总 RNA 的获得  25-26
    2.3.3 RNA 样品的 DNase I 处理  26-27
    2.3.4 cDNA 第一链的合成  27-28
    2.3.5 RNAi 表达载体的构建  28-32
  2.4 结果与分析  32-37
    2.4.1 目的片段的获得  32-33
    2.4.2 第一链的插入  33-34
    2.4.3 第二链的插入  34-36
    2.4.4 RNAi 表达载体的获得  36-37
  2.5 讨论  37-39
第三章干涉表达载体对水稻日本晴的遗传转化  39-52
  3.1 前言  39
  3.2 材料与试剂  39
    3.2.1 材料  39
    3.2.2 培养基  39
  3.3 实验方法  39-44
    3.3.1 日本晴愈伤组织的诱导及继代培养  39-40
    3.3.2 RNAi 载体农杆菌的活化  40
    3.3.3 侵染及共培养  40
    3.3.4 筛选培养  40-41
    3.3.5 分化培养  41
    3.3.6 生根培养及大田移栽  41
    3.3.7 T0 代转化植株在 DNA 水平上的阳性鉴定  41-42
    3.3.8 T0 代阳性植株在 RNA 水平的定量检测  42-44
  3.4 结果与分析  44-50
    3.4.1 RNAi 载体对日本晴的遗传转化  44-45
    3.4.2 干涉 osvdac7 基因转化植株的分子检测  45-47
    3.4.3 osvdac4 基因 RNAi 植株的分子检测  47-49
    3.4.4 所获 T0 代转化植株数量统计  49
    3.4.5 干涉 osvdac4 基因 T1 代植株的阳性检测  49-50
  3.5 讨论  50-52
第四章水稻 osvdac7 基因下调植株中 8 个 osvdac 的表达水平分析  52-58
  4.1 前言  52
  4.2 材料和试剂  52
    4.2.1 试验材料  52
    4.2.2 试验试剂  52
  4.3 实验方法  52-54
    4.3.1 qRT-PCR 引物设计  52-53
    4.3.2 osvdac7 基因下调植株 RNA 的提取  53
    4.3.3 RNA 的 DNaseI 处理  53
    4.3.4 单链 cDNA 的合成  53
    4.3.5 cDNA 质量检测  53
    4.3.6 水稻 8 个 osvdac 基因的表达量分析  53-54
  4.4 结果与分析  54-56
  4.5 讨论  56-58
参考文献  58-69
致谢  69-70
附录一：相关试剂及培养基的配制方法  70-72
附录二：相关激素和抗生素的配制  72-73
在读期间发表的论文  73
参与的科研课题及学术活动  73

水稻osvdac基因RNAi载体的构建及其在转基因植株中的表达分析

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