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槐定碱对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路的影响

作　者: 杨峰
导　师: 曹相原；周娅
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 内科学
关键词: 槐定碱 内毒素 NF-κBP65 IKKβ IκBα TNF-α
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的观察槐定碱对RAW264.7巨噬细胞中LPS介导的NF-κB信号转导通路上关键信号分子IKKβ、IκBα、NF-κB P65及下游主要炎症介质TNF-α的影响,以探讨其抗内毒素的药理机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞,LPS刺激RAW264.7细胞,建立细胞炎症反应模型。实验分为空白对照组、槐定碱对照组、LPS模型1组、槐定碱干预组、LPS模型2组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组。各组处理完毕后5、30、60、120分钟,分别获取细胞与培养液。Western Blot检测细胞IκBα、pIκBα、NF-κB P65蛋白表达,RT– PCR检测IKKβ、IκBα、NF-κB P65mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果(1)槐定碱本身对所检测的RAW264.7细胞的各项指标的表达均无影响;LPS模型1组RAW264.7细胞各时间点IKKβ、NF-κB P65的mRNA与蛋白及pIκBα的表达、培养液中TNF -α表达均显著高于空白对照组(P <0.01),细胞中IκBαmRNA与蛋白表达均低于空白对照组(P < 0.01),上述指标均随LPS刺激时间延长而逐渐升高或降低,至120min未见下降或回升。槐定碱干预组各时间点RAW264.7细胞的IKKβ、NF-κB P65的mRNA与蛋白及pIκBα的表达、培养液中TNF -α表达均低于同时间点LPS模型1组,并随槐定碱作用时间延长各指标表达有逐渐下降趋势,直至120min。但各时间点均仍高于空白对照组(P < 0.01或P < 0.05);而槐定碱干预组IκBαmRNA及蛋白表达自30min起均显著高于同时间点LPS模型1组,持续至120min,但仍低于空白对照组(P < 0.01或P < 0.05)。槐定碱干预组各时间点之间TNF–α含量比较均有显著性差异(P < 0.01),表明槐定碱作用有时间依赖性。(2)LPS模型2组RAW264.7细胞各时间点IKKβ、NF-κB P65的mRNA与蛋白及pIκBα的表达、培养液中TNF -α表达均显著高于空白对照组(P <0.01),细胞中IκBαmRNA与蛋白表达均低于空白对照组(P < 0.01),上述指标均随LPS刺激时间延长而逐渐升高或降低,至120min未见下降或回升。槐定碱预处理组各指标表达趋势与LPS模型2组相似,但槐定碱预处理组各时间点IKKβ、NF-κB P65的mRNA与蛋白及pIκBα的表达、培养液中TNF-α表达均显著低于同时间点LPS模型2组(P < 0.01或P < 0.05);但高于空白对照组(P < 0.01或P < 0.05)。槐定碱预处理组IκBαmRNA及蛋白表达自30min起较同时间点LPS模型2组显著增高,持续至120min,但仍显著低于空白对照组(P < 0.01或P < 0.05)。(3)槐定碱预混合组各时间点IKKβ、NF-κB P65的mRNA与蛋白及pIκBα的表达、培养液中TNF-α表达均低于同时间点LPS模型2组(P < 0.01或P < 0.05);但高于同时间点空白对照组(P < 0.01或P < 0.05);槐定碱预混合组各时间点IκBαmRNA及蛋白表达均高于同时间点LPS模型2组,也高于空白对照组(P < 0.01或P < 0.05)。槐定碱预混合组各检测指标的各时间点结果连线均呈平直趋势。结论(1)槐定碱可抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NF-κB通路中IKKβmRNA表达,促进IκBmRNA及蛋白表达,减少IκB的磷酸化降解,下调NF-κB P65mRNA和蛋白表达,降低TNF-α的释放,表明槐定碱抗内毒素机制与其调控NF-κB通路有关。(2)槐定碱三种给药方式均可下调LPS激活的RAW264.7巨噬细胞IKKβ、NF-κB P65、pIκBα的mRNA和/或蛋白表达及其培养液中TNF-α含量,上调IκBmRNA和蛋白表达,但其时间-效应曲线随不同给药方式而改变,表明槐定碱可能通过多种方式发挥抗内毒素作用。(3)槐定碱对LPS诱导TNF–α分泌的干预结果显示,各时间点之间TNF–α含量均有显著性差异(P < 0.01),表明槐定碱抗内毒素作用具有时间依赖性。(4)本研究中槐定碱对照组与空白对照组之间所有检测数据的差异均无统计学意义,证实槐定碱15.63 mg.L-1浓度本身对RAW264.7巨噬细胞的NF-κB通路无影响。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
中英文缩略词表  9-11
前言  11-14
材料与方法  14-26
结果  26-42
讨论  42-50
结论  50-51
附图  51-55
参考文献  55-60
综述  60-67
  参考文献  65-67
致谢  67-68
攻读学位期间发表的学术论文  68-69
个人简历  69

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