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平滑肌收缩功能障碍通路上的基因多态性与主动脉夹层发生和预后的相关性分析

作　者: 黎明
导　师: 罗建方
学　校: 南方医科大学
专　业: 心血管内科
关键词: 单核甘酸多态性主动脉夹层平滑肌细胞
分类号: R543.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

主动脉夹层(aortic dissection, AD)是主动脉内膜撕裂,循环中的血液通过裂口进入主动脉肌壁内,导致血管壁分层。目前知道主动脉夹层通常与中层的结构改变有关,囊性中层坏死、纤维化、弹力纤维变脆,是本病特有的组织病理学改变。据国外报道,AD的发病率约为每年每百万人中5～30例[1]。在急诊中因胸背痛就诊的患者中AD占0.5%。多中心研究证实发病率男女比为2：1～51,[2]主动脉夹层早期阶段死亡率极高一些严重并发症如重度高血压、心包填塞、大出血、主动脉瓣重度返流和心、脑、肾等重要脏器缺血性损伤,均可威胁患者的生命。据文献报告约35%的主动脉夹层患者在起病后头24小时内死亡,在第一周与第二周死亡率持续升高(48小时内为50%、1周内为70%、2周内为80%),随着诊治技术水平的进步,目前院内死亡率已降至30%以下。目前,主动脉夹层患者院外5年和10年总体生存率大约分别为80%和40%,但是本病不是终生治愈。主动脉壁的病理过程不会完全终止,仍可能发生远期并发症主动脉瘤样扩张、破裂等。目前对其发病机制及预后的问题,了解得也不充分,研究发现胸主动脉夹层具有一种很强的遗传易感性。因此我们研究基因多态性对其发病和预后都有相关性。主动脉夹层的发病机理研究进展包括主动脉结构及成分的异常改变、基因遗传学变异,血液动力学和血管生物力学。主动脉结构及成分的异常改变包括中膜结构薄弱或缺陷、细胞外基质成分的异常、平滑肌细胞的异常、主动脉血供削弱。主动脉血管中膜由血管平滑肌(VSMC)、细胞外基质(ECM)蛋白组成,主要是弹性纤维和胶原。平滑肌细胞呈梭型,胞质内充满肌丝、中间丝和致密体,它们构成平滑肌细胞的收缩系统和细胞骨架系统[3]。血管平滑肌细胞和细胞外基质蛋白组成平衡是为维护胸主动脉重要的功能特性,特别要符合动脉血流动力学。在代谢平衡紊乱,在细胞外基质过度退化,可能导致血管壁逐渐恶化,扩张和破裂。平滑肌细胞(SMC)可通过合成细胞外基质中的结构和非结构蛋白来保证主动脉壁的黏弹性和抗压性。30%～35%的主动脉夹层动脉瘤存在中膜囊性坏死(cystic medial necrosis,CMN),其以弹力纤维的破碎和丢失,平滑肌细胞(SMC)的丢失和胶原组织及嗜碱性物质在间质的积聚为特征[4]。细胞外基质(ECM)成分的异常：将夹层累及的主动脉区与相应的正常对照区进行比较,发现前者弹性蛋白、非弹性蛋白和胶原等其他蛋白的含量明显增加,而弹性蛋白、胶原浓度明显降低,表明AD的胸主动脉基质存在局部性扩充,尤其是胶原浓度的减少,意味着主动脉壁变得更薄弱,更易发生破裂。平滑肌收缩功能障碍是导致主动脉夹层的重要因素,MMP9, MYH11, TGFBR2, FBLN5都是调节血管平滑肌收缩功能的基因,而且四个基因在主动脉夹层发病环节上发挥不同的效能,可以更深入的解释主动脉夹层患者之间的发病和预后的差异,以实现个体化用药,和治疗,预防术前和术后的并发症。国外研究结果显示四个候选基因都已被证实对主动脉夹层发病有影响,目前只有对MMP9进行了基因多态性的分析。本研究通过对我国患有主动脉夹层病人与正常人对照,对候选基因多态性进行分析,本文分两部分来探讨候选基因变异在主动脉夹层发病和预后中的意义。第一部分MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多态性与主动脉夹层的关系研究目的：分析MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多态性与主动脉夹层发病的相关性,探讨遗传因素对主动脉夹层发病的影响对象与方法：(1)病例筛选,符合入选标准和排除标准的患者个人资料和临床资料的收集,剔除在研究过程中资料不够完善以及结果欠缺的病例；(2)候选基因的选取,对所有入选病例进行SNP基因分型检测；1)研究对象主动脉夹层组：入选病例为2008年12月至2010年3月就诊于广东省人民医院的107例主动脉夹层患者,男98例(92.3%),平均年龄为55.7岁,女9例。全部患者年龄29～81(55.7±12.2)岁。均为汉族,彼此无亲缘关系。对照组：我院体检无心血管疾病患者110例,均为汉族。其中男91例(82.7%)平均年龄为55.6±14.4。主动脉夹层的诊断均经增强CT证实,采用Stanford分型,其中A型25例,B型82例。研究对象自愿参加并签署知情同意书。2)收集资料我们对107例主动脉夹层的病人进行了个人资料和临床资料的收集,我们详细记录了患者的性别、年龄、是否吸烟、血压、血脂、治疗方案、预后等。3)选择SNP对于SNPs的选择,本研究根据标签SNPs、功能性SNPs、已发表的文献以及最小等位基因频率(MAF≥10%)对MYH11的SNPs进行了选择。标签SNPs是根据Haploview软件的Tagger程序筛选后得出,功能性SNP的选择是根据FASTSNP基于表型和潜在的功能性影响的危险因素分数,再加上SNPselector基于影响基因表达调控的保守区域、CpG岛和]microRNA而得到的分数。根据已发表的文献有非常重要意义的SNP也选择在内。最后入选的MYH11的SNPs为rs1050113C>T.rs1050162G>A、rs1050111C>T. rs880071G>A, MMP9的SNPs为rs17577G>A、rs3918254C>T、rs2250889C>G. rs2274755G>T,FBLN5的SNPs为rs2430347G>A、rs2498847T>C, TGFBR2的SNPs为rs2228048C>T。4)基因分型.取患者血样4 mL置于硅烷化的EDTA抗凝管,颠倒几次。立即将血样送呈实验室分离白细胞,用TIANGEN公司DNA分离试剂盒提取基因组DNA(Tiangen Biotech, Beijing, China)。标本冻存于-70℃低温冰箱。最后确定的MYH11基因的4个SNP的基因型通过基于单碱基引物延伸原理的Multiplex SNaPshot SNP分型技术(ABI Prism SNaPShotTM Multiplex kit, ABI, Foster City, CA, USA)对所有的DNA样本进行SNPS基因型检测。结果：①主动脉夹层合并高血压病为主动脉夹层发病前有明确高血压病史的患者,比较主动脉夹层合并高血压病与单纯主动脉夹层患者之间基因型有无相关性。说明MYH11、MMPS9、FBLN5和TGFBR2基因型与主动脉夹层患者合并高血压病无相关性。(P>0.05)②汉族人MYH11基因rs1050111C>T纯合子(CC)表型的频率最高,rs1050111C>T杂合子(CT)频率次之,纯合子(TT)频率最低。主动脉夹层组患者CC基因型的频率显著高于CT基因型频率；同样,对照组中CC基因型的频率也是显著高于CT基因型频率,两组基因型是有统计学差异。证明CC基因型的发生主动脉夹层的风险比(OR)高于CT基因型,差异有统计学意义。(P<0.05)③以分类变量主动脉夹层组和对照组为因变量,以MYH11 rs1050111C>T基因型作为自变量进行风险因素分析,回归分析采用进入法。经性别、年龄、高血压、血糖和血脂等因素校正后,CC基因型的发生主动脉夹层的风险比(OR)仍高于CT基因型携带者,差异有统计学意义。(P<0.05)。④Stanford A型的主动脉夹层患者中MMP9基因rs117577G>A GG基因型的频率显著高于GA/AA基因型频率；同样,Stanford B型患者GG基因型较GA/AA基因型更常见,两组的差异有统计学意义。(P<0.05)GA基因型的发生StanfordA型主动脉夹层的风险比(OR)高于GG基因型。结论：①MYH11基因rs1050111C>T的CC基因型对主动脉夹层的风险比(OR)高于CT/TT基因型,rs1050111C>T可能是主动脉夹层发病的遗传易感因素。②MMP9基因rs117577G>A的GA基因型对StanfordA型主动脉夹层的风险比(OR)高于GG基因型,rs117577G>A可能是主动脉夹层StanfordA型的遗传易感因素。第二部分MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多态性对主动脉夹层预后影响的研究研究目的：本研究在第一部分的基础上,进一步分析MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多态性与主动脉夹层患者的预后指标的关系,探讨遗传因素对主动脉夹层患者预后的影响。对象与方法：(1)病例筛选,符合入选标准和排除标准的患者个人资料和临床资料的收集,剔除在研究过程中资料不够完善以及结果欠缺的病例；(2)候选基因的选取,对所有入选病例进行SNP基因分型检测；1)研究对象主动脉夹层组：入选病例为2008年12月至2010年3月就诊于广东省人民医院的107例主动脉夹层患者,男98例(92.3%),平均年龄为55.7岁,女9例。全部患者年龄29～81(55.7±12.2)岁。均为汉族,彼此无亲缘关系。对照组：我院体检无心血管疾病患者110例,均为汉族。其中男91例(82.7%)平均年龄为55.6±14.4。主动脉夹层的诊断均经增强CT证实,采用Stanford分型,其中A型25例,B型82例。研究对象自愿参加并签署知情同意书。2)收集资料我们对107例主动脉夹层的病人进行了个人资料和临床资料的收集,我们详细记录了患者的性别、年龄、是否吸烟、血压、血脂、治疗方案、预后及并发症等。3)选择SNP对于SNPs的选择,本研究根据标签SNPs、功能性SNPs、已发表的文献以及最小等位基因频率(MAF>10%)对MYH11的SNPs进行了选择。标签SNPs是根据Haploview软件的Tagger程序筛选后得出,功能性SNP的选择是根据FASTSNP基于表型和潜在的功能性影响的危险因素分数,再加上SNPselector基于影响基因表达调控的保守区域、CpG岛和microRNA而得到的分数。根据已发表的文献有非常重要意义的SNP也选择在内。最后入选的MYH11的SNPs为rs1050113C>T、rs1050162G>A、rs1050111C>T、rs880071G>A, MMP9的SNPs为rs17577G>A. rs3918254C>T、rs2250889C>G、rs2274755G>T, FBLN5的SNPs为rs2430347G>A.rs2498847T>C, TGFBR2的SNPs为rs2228048C>T。4)基因分型.取患者血样4 mL置于硅烷化的EDTA抗凝管,颠倒几次。立即将血样送呈实验室分离白细胞,用TIANGEN公司DNA分离试剂盒提取基因组]DNA(Tiangen Biotech, Beijing, China)。标本冻存于-70℃低温冰箱。最后确定的MYH11基因的4个SNP的基因型通过基于单碱基引物延伸原理的Multiplex SNaPshot SNP分型技术(ABI Prism SNaPShotTM Multiplex kit, ABI, Foster City, CA, USA)对所有的DNA样本进行SNPs基因型检测。结果：①MYH11rs1050162G>A三组基因型间,携带MYH11rs1050162G>A携带纯合型(AA)和杂合型突变型(GA)的患者比纯合型(GG)的患者的1年内的发生SAE要高(x2=5.935,P=0.015),两组的差异有统计学意义(P<0.05)纯合型(GG)的OR值为2.033,95%CI：0.717,5.764,说明MYH11rs1050162G>A纯合型(AA)的基因型的患者1年内发生MACE的风险比(OR)要高于GA/GG基因型。②比较MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因的11个位点等位基因的频率与精神症状的发生无显著的差异。(P>0.05)说明MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因与精神症状的发生无相关性。③比较MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因的11个位点等位基因的频率与内漏的发生无显著的差异。(P>0.05)说明MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因与内漏的发生无相关性。④FBLN5的rs2498847T>C C突变等位基因比携带T等位基因的患者收缩压要高,两组的差异有统计学意义(P<0.05)。FBLN5的rs2498847T>C的C突变等位基因的患者入院时收缩压的风险比(OR)比T等位基因要高。结论：①MYH11rs1050162G>A的纯合型(AA)的基因型对主动脉夹层患者1年内发生MACE的风险比(OR)高于GA/GG基因型,rs1050162G>A可能是主动脉夹层预后的遗传易感因素。②FBLN5的rs2498847T>C的C突变等位基因的患者入院时收缩压的风险比(OR)比T等位基因要高。rs2498847T>C可能是入院时的收缩压的遗传易感因素。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-22
第一部分 MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多态性与主动脉夹层的关系  22-40
  一、材料与方法  22-29
  二、结果  29-35
  三、讨论  35-39
  四、结论  39-40
第二部分 MYH11、MMP9、FBLN5和TGFBR2基因多态性对主动脉夹层预后的影响的研究  40-51
  一、材料与方法  40-43
  二、结果  43-47
  三、讨论  47-50
  四、结论  50-51
本研究的局限性  51-52
小结和展望  52-53
参考文献  53-59
英文缩略词表  59-60
研究生期间发表的论文  60-61
致谢  61-63
统计学证明  63-64

平滑肌收缩功能障碍通路上的基因多态性与主动脉夹层发生和预后的相关性分析

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