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降血糖蛋白E2HSA的体外活性和体内药代动力学研究

作　者: 宋佃卫
导　师: 王德才；窦桂芳
学　校: 泰山医学院
专　业: 药理学
关键词: E2HSA Exendin-4 生物活性 CLEIA 药物代谢动力学
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:研究多肽类降血糖药物E2HSA的体外活性和动物体内药代动力学特点。方法:通过测定E2HSA和Exendin-4刺激胰岛瘤细胞（RINm-5F细胞）产生cAMP的量来反映其体外生物活性;建立化学发光酶联免疫检测法（CLEIA）测定猕猴血清中E2HSA和Exendin-4的浓度并对其进行方法学确证;研究比较E2HSA和Exendin-4在猕猴体内的药代动力学特征;采用硫酸铵盐沉淀法结合CLEIA研究E2HSA在猕猴体内的代谢转化和活性形式研究。结果和结论:1.用E2HSA和Exendin-4刺激RINm-5F细胞,使其与细胞上的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体结合,孵育一段时间后,用细胞裂解液将细胞裂解,释放出第二信使cAMP,用自主研发的免疫试剂盒测定细胞裂解释放出的cAMP含量。随着受体激动剂E2HSA、Exendin-4浓度的升高,细胞产生的cAMP量逐渐增多。但当药物浓度增加到一定程度时,细胞产生的cAMP量达到一个平台期,可能是由于药物和细胞上的受体结合达到饱和状态。E2HSA和Exendin-4的EC50分别是9.12μmol·mL^-1和0.07μmol·mL^-1,表明E2HSA生物活性比Exendin-4的生物活性低,推测其原因,可能是由于E2HSA中连接有白蛋白,体积大,和细胞受体结合时E2HSA空间位阻影响了其亲和力。2.建立了专属性好、准确、精密的CLEIA法分析生物样品中E2HSA和Exendin-4的含量,在E2HSA浓度2-500 ng·mL^-1范围内与其它类型白蛋白无明显交叉反应,最低定量下限为2 ng·mL^-1,具有良好的线性关系。板内精密度为2.5 %-7.2 %,板间精密度为6.4%-15.2 %,准确度为-3.0%-1.2%。样品稳定性实验表明,E2HSA 3个质控浓度的血清样品在-80℃冻存6天稳定,精密度为3.2%-7.9%,准确度为-3.7%--10.1%,血清样品稀释50倍和100倍后无稀释效应。Exendin-4的标准曲线范围是1-100 ng·mL^-1,最低定量下限为100 ng·mL^-1,具有良好的线性关系。板内精密度和板间精密度为5.3%-11.6%和1.1%-14.1%,准确度为1.7%-7.0%。此方法能满足E2HSA和Exendin-4的临床前药代动力学研究要求。3.猕猴单次皮下注射0.3 mg·kg^-1(39.3×10-10 mol·kg^-1)E2HSA后,清除半衰期是61.38h,AUC（0-t）是9272.91 ng·h·mL^-1,CL是32.15 mL·h·kg^-1,MRT（0-t）是168.72h,猕猴单次皮下注射15μg·kg^-1(42.97×10-10 mol·kg^-1) Exendin-4后,在6h后基本检测不到血药浓度,E2HSA的半衰期明显延长。4.硫酸铵盐沉淀法结合CLEIA法可以检测E2HSA进入动物体内的代谢转化情况,包括检测原形E2HSA的浓度和其代谢产物Exendin-4的浓度。E2HSA进入动物体内后,小分子Exendin-4逐渐从E2HSA上脱落下来。E2HSA在体内逐步转化成活性更高的形式Exendin-4发挥降血糖作用。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
符号说明  9-10
前言  10-15
第一章 E2HSA 生物活性测定方法以及与Exendin-4 生物活性比较研究  15-25
  实验原理  15-16
  实验材料  16-17
  实验方法  17-21
  结果  21
  实验结果  21-24
  讨论及小结  24-25
第二章猕猴血清中E2HSA 和Exendin-4 的定量检测分析方法的建立  25-39
  实验原理  25
  实验材料  25-26
  实验方法  26-30
  实验结果  30-36
  讨论及小结  36-39
第三章 E2HSA 与Exendin-4 在猕猴体内的药代动力学特点比较研究  39-45
  实验材料  39-40
  实验方法  40-41
  实验结果  41-44
  讨论及小结  44-45
第四章 E2HSA 的体内代谢转化及活性形式研究  45-56
  实验原理  45
  实验材料  45-46
  实验方法  46-49
  实验结果  49-55
  讨论及小结  55-56
结论  56-57
参考文献  57-59
综述  59-68
  参考文献  65-68
致谢  68-69
攻读学位期间发表的学术论文  69

降血糖蛋白E2HSA的体外活性和体内药代动力学研究

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