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淹水胁迫下活性氧及抗氧化酶活性变化对小麦胚乳细胞编程性死亡进程的影响

作　者: 成祥旭
导　师: 周竹青
学　校: 华中农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小麦(Triticum aestivum L.)品种淹水胁迫胚乳细胞细胞编程性死亡活性氧抗氧化酶
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

前期研究表明淹水胁迫会导致小麦胚乳细胞编程性死亡(programmed cell death, PCD)进程提前。为探寻其发生的细胞生物学机制,本研究以耐湿品种华麦8号(Hua 8)和不耐湿品种华麦9号(Hua 9)为材料,在小麦开花期进行淹水处理,从显微和超微结构水平研究了胚乳发育过程中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的动态变化；利用实时定量PCR研究了胚乳细胞中抗氧化关键酶：NADPH硫氧还蛋白还原酶(NADPH thioredoxin reductase, NTR)、Mn超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase, MnSOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)的基因表达情况,同时研究了SOD、CAT的活性变化。另外,研究了利用抗坏血酸、甘露醇2种活性氧清除剂处理淹水植株和利用外源过氧化氢(H2O2)处理未淹水植株对小麦胚乳细胞PCD进程的影响。研究结果表明：1.未淹水处理下,荧光探针检测到耐湿品种Hua 8和不耐湿品种Hua 9胚乳细胞中ROS含量均在12 DAF(开花后天数)、15 DAF升高,此后减少；并且超微细胞化学定位发现,在12 DAF和15 DAF,H2O2和O2-主要在细胞壁、细胞膜、线粒体中积累。淹水7d处理下,与未淹水处理相比,Hua 8和Hua 9胚乳细胞中ROS含量均大量增加,并在12 DAF达到最大,此后逐渐减少。高强度淹水胁迫下(淹水12 d),Hua 8和Hua 9胚乳细胞中ROS含量依然在12 DAF达到最高水平；此后,Hua 8逐渐减少,而Hua 9依然非常高,直到18 DAF时才开始减少。超微细胞化学定位发现,在12 DAF和15 DAF,Hua 8和Hua 9胚乳细胞中H2O2、O2-在细胞壁、细胞膜、线粒体处大量积累,而且细胞膜变形破裂,线粒体膨胀破裂。2.未淹水处理下,在12 DAF至18 DAF之间,耐湿品种Hua 8和不耐湿品种Hua 9胚乳细胞中抗氧化酶NTR、MnSOD、CAT基因表达量逐渐降低,SOD和CAT活性不断下降。淹水7d处理下,与未淹水处理相比,Hua 8同期胚乳细胞中CAT基因表达量升高,但活性下降,说明CAT可能在转录后和翻译后受到了抑制；MnSOD表达量升高,SOD活性升高,并且NTR表达量较大幅度的升高。而Hua 9同期胚乳细胞中CAT基因表达量和活性均较大幅度的下降,而且MnSOD表达量和SOD活性下降,并且NTR表达量较小幅度的升高。高强度淹水胁迫下(淹水12 d),Hua 9胚乳细胞中CAT和SOD活性下降的幅度加大,并且NTR基因表达量在15 DAF开始下降；而Hua 8胚乳细胞中SOD活性依然增加,且NTR基因表达量增加的幅度加大。3.用10、100、200 mmol/L外源H202处理均能导致胚乳细胞Evans Blue着色变深,发生PCD的细胞增多。DNA laddering检测发现100、200 mmol/L H2O2处理均能导致胚乳细胞DNA片段化加剧,且200 mmol/L H2O2处理的胚乳细胞DNA片段化更为严重。说明,外源H202能够导致胚乳细胞PCD加剧。4.活性氧清除剂显著抑制了淹水胁迫对胚乳细胞PCD进程的推动作用。利用抗坏血酸、甘露醇2种活性氧清除剂处理淹水植株,与未处理的淹水植株相比,Evans Blue着色变浅,胚乳细胞DNA片段化减轻。上述结果表明,ROS介导了正常生长胚乳细胞的PCD过程。淹水胁迫下,抗氧化酶活性下降和ROS积累可能是胚乳细胞PCD加剧和进程提前的主要原因。ROS可能作为信号分子调控胚乳细胞中与代谢相关基因的表达水平,或者直接对细胞内结构和抗氧化关键酶造成氧化损伤,诱导了胚乳细胞PCD进程提前。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-13
1 前言  13-26
  1.1 细胞编程性死亡  13-14
  1.2 胚乳细胞的PCD及其检测方法  14-16
    1.2.1 胚乳细胞的PCD  14-15
    1.2.2 PCD的检测方法  15-16
  1.3 淹水胁迫对植物发育的影响  16-18
    1.3.1 淹水胁迫对植物生理生化的影响  16-17
    1.3.2 淹水胁迫诱导的植物细胞PCD  17-18
  1.4 ROS产生机制及其在PCD中的作用  18-23
    1.4.1 ROS产生机制  18-19
    1.4.2 ROS在PCD中的作用  19-21
    1.4.3 在细胞中定位ROS的方法  21-23
    1.4.4 PCD过程中的Ca~(2+)、激素等信号  23
  1.5 植物细胞中的ROS清除系统  23-25
    1.5.1 抗氧化酶系统  23-25
    1.5.2 非酶促系统  25
  1.6 本研究的目的及意义  25-26
2 材料与方法  26-31
  2.1 材料培养与处理  26-27
    2.1.1 材料培养  26
    2.1.2 淹水处理  26
    2.1.3 淹水条件下喷施抗坏血酸和甘露醇  26-27
    2.1.4 外源H_2O_2处理  27
  2.2 胚乳细胞PCD检测  27-28
    2.2.1 Evans Blue染色  27
    2.2.2 DNA laddering条带检测  27-28
  2.3 ROS检测  28-29
    2.3.1 超氧阴离子(O_2~-)的光学检测  28
    2.3.2 ROS的荧光检测  28
    2.3.3 H_2O_2的超微细胞化学定位  28-29
    2.3.4 O_2~-的超微细胞化学定位  29
  2.4 抗氧化酶活性测定  29-30
  2.5 抗氧化酶基因表达量检测  30-31
    2.5.1 胚乳细胞RNA的提取  30
    2.5.2 cDNA第一链的合成  30
    2.5.3 实时定量PCR反应  30-31
3 结果  31-42
  3.1 胚乳细胞PCD检测  31-33
    3.1.1 Evans Blue染色检测PCD  31-32
    3.1.2 DNA laddering检测  32-33
  3.2 ROS的显微和超微细胞化学定位  33-35
    3.2.1 超氧阴离子(O_2~-)的显微定位  33
    3.2.2 ROS荧光检测  33-34
    3.2.3 H_2O_2超微细胞化学定位  34-35
    3.2.4 O_2~-超微细胞化学定位  35
  3.3 抗氧化酶活性  35-38
    3.3.1 SOD活性  35-36
    3.3.2 CAT活性  36-38
  3.4 抗氧化酶系统关键酶基因的相对表达量  38-42
    3.4.1 MnSOD基因相对表达量  38-39
    3.4.2 CAT基因相对表达量  39-41
    3.4.3 NTR基因相对表达量  41-42
4. 讨论  42-51
  4.1 ROS在胚乳细胞PCD中的作用  42-47
    4.1.1 ROS参与了正常发育胚乳细胞的PCD过程  42-43
    4.1.2 淹水胁迫下胚乳细胞ROS的积累导致PCD加剧  43-45
    4.1.3 ROS调控PCD的模式  45-46
    4.1.4 ROS与乙烯、Ca~(2+)协同作用调控PCD  46-47
  4.2 耐湿性不同的品种间淹水胁迫生理效应比较  47-48
  4.3 本研究方法上的创新和不足  48-49
    4.3.1 PCD检测  48
    4.3.2 ROS超微定位  48-49
    4.3.3 实时定量PCR检测抗氧化关键酶基因表达量  49
  4.4 展望  49-51
参考文献  51-62
附录1 在读期间发表和拟发表的论文  62-63
附录2 论文图版  63-82
致谢  82

淹水胁迫下活性氧及抗氧化酶活性变化对小麦胚乳细胞编程性死亡进程的影响

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