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猪AGL基因启动子活性初步研究

作　者: 胡浩然
导　师: 伍晓雄；吴健
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪 AGL 启动子 HNF-3β
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


AGL基因编码的糖原脱脂酶是参与糖原降解的一种复合酶,包括α-葡聚糖转移酶和淀粉-1,6-葡糖苷酶、脱支酶两种功能。目前,人和马的AGL基因的研究主要集中于结构和功能。有关于猪AGL基因的研究报道比较少。本文以猪AGL 5’侧翼序列为研究对象,探讨5’侧翼序列的启动子活性,主要研究结果如下：猪AGL 5’侧翼序列启动子活性研究构建AGL 5’侧翼序列驱动的虫荧光素酶基因表达质粒pGL3-5’UTR,转染L02细胞。转染48h后用双荧光素酶报告基因检测试剂盒,检测荧光素酶的表达情况；转染24h后用逆转录聚合酶反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平。与阴性对照pGL3-basic作比较,pGL3-5’UTR有显著的虫荧光素酶表达(P<0.01)；反转录PCR反应也得到相符的结果,pGL3-5’UTR检测到虫荧光素酶基因mRNA。结果表明,AGL 5’侧翼序列具有成熟的启动子活性,能够启动下游基因的表达。猪AGL 5’侧翼序列启动子活性的结构定位利用生物信息学方法对5’末端非编码区进行分析,该序列中存在TATA框、CAAT框、GC框和一些可能的转录因子结合位点,如Smad3、Smad4、C/EBPβ、MAZF、USF、SP1、AP-2、MEF2、MyoD和HNF-3p/foxa2等。以pGL3-5’UTR为模板构建系列缺失表达载体,转染L02和C2C12细胞,进行双荧光素酶报告基因检测和反转录PCR反应检测。与阴性对照pGL3-basic相比,pGL3-233、pGL3-416、pGL3-495、pGL3-607和pGL3-690都具有明显的启动子活性。pGL3-416的活性显著高于pGL3-233 (P<0.05); pGL3-690的活性显著高于pGL3-607 (P<0.05)=反转录PCR反应结果与之相符。结果显示,AGL 5’侧翼序列翻译起始位点上游218bp开始具有基本启动子活性；-411--228bp和-685--602bp的区段内可能有非常重要的顺势作用元件。-412--229bp序列分析表明,发现该区段含有HNF-3β保守结合位点。利用重叠延伸PCR技术,以pGL3-690为模板,对HNF-3β结合序列进行突变,构建突变表达载体pGL3-△-690。分别转染L02和C2C12细胞,与pGL3-690相比,pGL3-△-690活性分别下降98%和84%,结果提示,HNF-3β在AGL的转录调控过程中发挥重要的作用。猪AGL 5’侧翼序列启动子活性的组织表达特异性选取具有较高转录活性的pGL3-690和pGL3-5’UTR载体,分别转染L02和C2C12细胞。结果显示,pGL3-5’UTR和pGL3-690在细胞系C2C12中的活性比在细胞系L02中的高,但差异不显著。结果提示,5’UTR和690这两段序列的转录活性不具有组织特异性,AGL5’侧翼序列转录活性的组织特异性有待进一步研究。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表  10-11
1 文献综述  11-20
  1.1 糖原累积病  11-12
  1.2 mRNA选择性剪接  12-13
  1.3 AGL基因研究进展  13-15
  1.4 基因启动子研究进展  15-17
  1.5 定点突变的研究方法  17-19
  1.6 HNF-3的生物学特性及其在AGL转录与复制中的作用  19-20
2 研究的目的和意义  20-21
3 材料和方法  21-33
  3.1 试验材料  21-24
    3.1.1 细胞  21
    3.1.2 质粒和菌株  21-22
    3.1.3 主要试剂及溶液  22-23
    3.1.4 主要仪器和设备  23-24
    3.1.5 主要应用的生物学软件及相关的网站  24
  3.2 试验方法  24-33
    3.2.1 构建表达载体的片段的获得  24-27
    3.2.2 表达载体的构建  27-29
    3.2.3 细胞培养  29-30
    3.2.4 细胞转染  30
    3.2.5 双荧光素酶活性测定与分析  30-31
    3.2.6 RT-PCR检测虫荧光素酶mRNA  31-33
4 结果与分析  33-43
  4.1 猪AGL基因启动子序列的生物信息学分析  33-34
  4.2 猪AGL基因启动子目的片段的获得  34-35
  4.3 猪AGL基因2的荧光素酶报告基因表达载体的构建  35-36
  4.4 猪AGL基因不同表达载体的荧光素酶的相对活性  36-43
    4.4.1 猪AGL 5’侧翼序列启动子活性的验证  36-38
    4.4.2 猪AGL 5’侧翼启动子活性的结构定位  38-41
    4.4.3 HNF-3β结合序列在转录调控过程中的作用  41
    4.4.4 pGL3-5’UTR和pGL3-690转录活性的组织特异性研究  41-43
5 讨论  43-46
  5.1 关于猪AGL 5’侧翼序列的启动子活性  43
  5.2 猪AGL 5’侧翼序列启动子活性的结构  43-44
  5.3 关于突变表达载体的构建  44-45
  5.4 AGL基因启动子活性组织特异性分析  45-46
6 结论  46-47
参考文献  47-52
致谢  52

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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