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不同方法制备大鼠肝脏脱细胞支架及其免疫原性和细胞相容性研究

作　者: 姜楠
导　师: 窦科峰
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 脱细胞肝支架肝组织工程细胞外基质免疫原性卵圆细胞
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目前治疗终末期肝病的一个有效方案是肝移植，但因为供肝不足，使大多数终末期肝病患者无法获得有效的治疗。即使接受了肝移植，病人也需要终身服用免疫抑制剂。肝组织工程的发展为终末期肝病的治疗提供了新的可能。本实验采用的全器官脱细胞支架是利用物理（振荡，高渗，低温等）、化学（酸、碱、去垢剂等）或酶解（胰蛋白酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶）等方法去除器官中细胞成分和遗传物质后得到的生物支架。该支架保留了肝脏完整的三维立体结构和大部分的细胞外基质成分，为后期种植种子细胞构建组织工程肝脏提供基础。目前国内外的多家机构通过不同的方法制备肝脏脱细胞支架，而我们在前期研究中也利用以NP-40和多种生物酶为主的多步方案也成功制备出大鼠肝脏脱细胞支架。目前尚无对几种洗脱方案系统化的比较。影响支架使用的一个重要因素是其免疫原性，尽管研究证实洗脱过程已去除了引起免疫反应的细胞物质，但生物材料移植之后仍可引起强烈的免疫排斥反应。影响支架使用的另一重要因素是其细胞相容性，通过在支架上种植种子细胞观察其粘附、生长、分化、迁移情况，可初步判断制备的脱细胞支架在清除掉细胞成分的同时，是否保留了适于细胞生长的结构和成分。本实验通过对比两种传统方法和一种新方法制备大鼠肝脏脱细胞支架的理化性质、免疫原性以及细胞相容性，为肝脏组织工程的体内、体外研究奠定基础。目的：使用不同方案制备大鼠肝脏脱细胞支架，检测支架成分和体内重塑反应，以及种植细胞后细胞在支架上的生长情况，比较不同方法制备DLB的免疫原性和生物相容性效果。方法：1．选取文献报道的三种方案（分别以SDS，Triton X-100和NP-40为主要洗脱成分），制备F344大鼠DLB。2．免疫原性部分进行HE和Masson染色，检测DLB中DNA、氨基葡聚糖（GAG）以及羟脯氨酸（HYP）含量；再将DLB埋植于C57BL/6小鼠的背部皮下，于术后第3、7和14天取出后进行形态学观察和组织学评分。3．细胞相容性部分进行氨基葡聚糖（GAG）检测、扫描电镜、细胞毒性实验，后经门静脉灌注肝卵圆细胞，进行免疫荧光、扫描电镜、粘附率和白蛋白分泌检测。结果：1．三种方案均成功制备出符合脱细胞标准的大鼠DLB；2．形态学结果提示Triton X-100和NP-40方案较SDS方案能更好地保护肝脏超微结构；成分检测结果发现NP-40方案去除DNA的能力显著强于SDS和Triton X-100方案（P＜0.05），而对GAG含量的洗脱作用最弱（P＜0.05）；异种体内埋置实验提示NP-40方案制备的DLB引起的免疫反应强度明显弱于SDS和Triton X-100方案，体内重塑结局评分显著高于SDS和Triton X-100方案。3．大体观察、扫描电镜及孔径计算表明NP-40方案细胞外基质较SDS和TritonX-100方案整齐；GAG检测NP-40方案高于Triton X-100方案和SDS方案；支架细胞毒性结果证实支架对细胞增殖起促进作用；细胞粘附率结果表明NP-40方案高于SDS方案和Triton X-100方案；免疫荧光及扫描电镜示NP-40方案细胞排列整齐；白蛋白分泌NP-40方案(85.77±3.30mg/106个细胞)明显好于SDS方案(49.37±2.43mg/106个细胞)和Triton X-100方案(74.66±4.80mg/106个细胞)。结论：与SDS和Triton X-100方案相比，NP-40方案能更有效地去除肝脏DNA，较好地保留GAG，诱导移植受体对DLB的良性重塑反应，且有利于细胞在支架上的粘附、生长、分化、迁移。为进一步的体内研究提供更优化的支架。

不同方法制备大鼠肝脏脱细胞支架及其免疫原性和细胞相容性研究

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